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1、LB 培养基液态培养基根据 分子克隆实验指南 （ J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔著）配制每升培养基 ,应该在 950 ml 去离子水中加入 : 胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L 酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L 氯化钠 (NaCl) 10g/L 摇动容器直至溶质溶解 .用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容至 1L.在 15psi（ 121）高压下蒸汽灭菌 20min. （ 1.05kg/cm3）150ml 的配方如下 ：胰蛋白胨 (Tryptone) 1.5g/L 酵母提取物 (Yeast extract) 0.75g/L 氯化钠 (Na
2、Cl) 1.5g/L 固态培养基LB 固体培养基 1L 和液体一样，加 15g 琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。LB固体培养基倒板1.配制： 100mlLB 培养基加入 1.5g 琼脂粉2.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置与 55的水浴中，待培养基温度降到 55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。3.倒板：一般 10ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15 分钟。4.保存：用封口胶封边，并倒置放于 4保存，一个月内使用。抗生素终浓度 Amp 100ug/ml,Kan 50ug/ml. LB
3、培养基是一种培养基的名称 ,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种 ,使菌种成倍扩增 ,达到使用要求 .培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌 .通过培养工程菌 ,我们可以表达大量的外源蛋白 ,也可以拿到带有外源基因的质粒 ,工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础 . 一、大肠杆菌质粒 DNA的提取质粒 DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术， 但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法： 此方法适用于 小量质粒 DNA的提取， 提取的质粒 DNA可直接用于酶切、 PCR扩增、银染序列分析。方法如下：1、接 1%含质粒的大肠杆菌细胞于 2ml L
4、B 培养基。2、 37振荡培养过夜。3、取 1.5ml 菌体于 Ep管，以 4000rpm离心 3min，弃上清液。4、加 0.lml 溶液 I （ 1葡萄糖， 25mM/L EDTA pH8.0， 25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合，漩涡振荡混匀。5、加入 0.2ml 溶液 II （ 0.4 M/L NaOH， 2 SDS）新鲜配制，轻轻翻转混匀（千万不可用漩涡震荡器，裂解时间不要超过 5min）。6、加入 0.15m1预冷溶液 III （ 5 mol/L KAc， pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴 15 min . 7、以 12， 000rpm离心 10min，取上清
5、液于另一新 Ep管8、向上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（去蛋白质和脂质），漩涡混匀， 12， 000rpm 离心 5min，将上清液转移到另一新 Ep 管9、向上清中加入等体积的氯仿：异戊醇（去微量酚和脂质），漩涡混匀， 12， 000rpm离心 5min，将上清液转移到另一新 Ep 管10、向上清中加入 2 倍体积的无水乙醇，漩涡混匀后，冰浴 30min， 12，000rpm 离心 10min，弃上清。11、 用 1ml 70%乙醇洗涤质粒 DNA沉淀 2 次， 每次 12， 000rpm离心 5min，弃上清，于空气中干燥（超净台上开大风干燥）或真空干燥。12. 待沉淀干燥后，溶于 0
6、.05mlTE 缓冲液中于 -20 C保存。煮沸法1、将 1.5ml 培养液倒入 eppendorf 管中， 4下 12000g 离心 30 秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3、将菌体沉淀悬浮于 120ml STET溶液中， 涡旋混匀。4、加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液（ 10mg/ml）， 涡旋振荡 3 秒钟。5、将 eppendorf 管放入沸水浴中， 50 秒后立即取出。6、用微量离心机 4下 12000g 离心 10 分钟。7、用无菌牙签从 eppendorf 管中去除细菌碎片。8、取 20ml 进行电泳检查。 注意 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌
7、落直接进行煮沸法提取质粒 DNA. 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。3. 提取的质粒 DNA中会含有 RNA， 但 RNA并不干扰进一步实验， 如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。质粒 DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA，为此需要大量提取质粒 DNA.大量提取的质粒 DNA一般需进一步纯化，常用 柱层析法和氯化绝梯度离心法 。（一）碱法1、取培养至对数生长后期的含 pBS质粒的细菌培养液 250ml， 4下5000g 离心 15 分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。2
8、、将细菌沉淀重新悬浮于 50ml 用冰预冷的 STE中（此步可省略）。3、同步骤 1 方法离心以收集细菌细胞。4、将细菌沉淀物重新悬浮于 5ml 溶液 I 中，充分悬浮菌体细胞。5、加入 12ml 新配制的溶液 II ， 盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴 10 分钟。6、加 9ml 用冰预冷的溶液 III ， 摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置 15 分钟，此时应形成白色絮状沉淀。7、 4下 5000g离心 15 分钟。8、取上清液，加入 50ml RNA酶 A（ 10mg/ml）， 37 水浴 20 分钟。9、加入等体积的饱和酚 / 氯仿，振荡混匀， 4下 12000
9、g 离心 10 分钟。10、取上层水相， 加入等体积氯仿，振荡混匀， 4下 12000g离心 10分钟。11、 取上层水相， 加入 1/5 体积的 4mol/L NaCl 和 10% PEG（ 分子量 6000） ，冰上放置 60 分钟。12、 4下 12000g 离心 15 分钟， 沉淀用数 ml 70%冰冷乙醇洗涤， 4下 12000g离心 5 分钟。13、真空抽干沉淀，溶于 500ml TE 或水中。 注意 1. 提取过程中应尽量保持低温。2. 加入溶液 II 和溶液 III 后操作应混和，切忌剧烈振荡。3. 由于 RNA酶 A中常存在有 DNA酶，利用 RNA酶耐热的特性，使用时应先对
10、该酶液进行热处理（ 80 1 小时），使 DNA酶失活。二、质粒 DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物， 应选用电泳纯的， 琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用 溴化乙锭 染色后荧光背景最小。（ 1）琼脂糖凝胶电泳装置由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去 15 年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。 对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是 Walter Schaffner 发明的水平板凝胶。水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中， 则可将凝胶直接铺在平台上。 凝胶恰好浸在缓冲液液面下进
11、行电泳。 凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同， 所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。（ 2）琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入 胶模 中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性 pH值下带负电荷的 DNA向阳极迁移。（ 3）琼脂糖凝胶的染色电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含 EB的染液中，染色 10 分钟，取出紫外灯下观察。三、大肠秆菌感受态细胞的制备感受态的细胞可以摄入外部溶液中的 DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒 DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞
12、。1、取 1%大肠杆菌 E.coli 接种于含 2ml LB 培养基的试管中， 37振荡培养过夜2、取 0.1ml 过夜培养物转种于含 10ml LB 培养基的三角瓶中， 37振荡培养 3h 至 OD600=0.3 3、然后把培养物倒入 1.5ml 离心管中，冰浴 10min. 4、在 4下以 4000rpm离心 5min，去上清液5、把菌体悬浮于 15m1冰冷的 0.1M CaCl2 溶液中，置冰上 30min 6、然后再在 4下以 4000rpm离心 10min，去上清液7、将菌体悬浮于 0.1ml CaCl2 溶液中，冰浴放置 4-12hr 备用。四、质粒 DNA高频转化大肠杆菌制备好感
13、受态细胞后，接下来就是质粒 DNA转化入大肠杆菌细胞的过程。 但要注意的是感受态细胞最好是新制备的， 因为保存一定时间的感受态细胞会使转化率降低；此外 DNA的浓度也要注意，不能太高。1、取新制备的一管感受态细胞。2、取 0.03ml 感受态细胞转和 4ng 质粒 DNA混匀，置冰浴 30min 3、将 Ep 管置于 42水浴中热冲击 2 分钟，立即置于冰上 1 分钟。4、在 Ep 管中加 70u1 LB 培养基混匀， 37培养 30min 5、涂在含适当浓度抗生素的 LB 平板上。6、 37培养过夜，长出的菌斑既为阳性克隆。五、线形质粒 DNA 5 - 粘性末端去磷酸经限制性内切酶酶切的质粒
14、 DNA 5端均带有磷酸集团，如用此载体直接转化大肠杆菌，其自身环化几率非常高，影响连接、转化效率。因此一般酶切的质粒 DNA要经 脱磷 ，使用碱性磷酸酶（ CIAP）去除 5端磷酸集团。方法如下：1、质粒 DNA和 CIAP以及 BUFFER 37水浴 30min 2、补充 CIAP 再 37水浴 30min 3、加入 50mM EDTA至终浓度 5mM 75加热 10min 失活 CIAP 4、冷却至室温，酚 - 氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩。5、抽干溶液，加适量 TE溶解。六、聚合酶链式反应（ PCR）技术PCR是一种选择性体外扩增 DNA或 RNA片段的方法。其特异性是由两个人工合成的引物序
15、列决定的。 所谓引物就是与待扩增 DNA片段 两翼 互补的寡聚核苷酸，其本质是 ssDNA片段。待扩增 DNA模版加热变性后，两引物分别与两条 DNA的两翼序列特异复性。此时，两引物的 3端相对， 5向背。在合适的条件下，由 Taq DNA聚合酶催化引物引导的 DNA合成，既引物的延伸。 上述过程是由温度控制。 这种热变性 - 复性 - 延伸的过程就是一个 PCR循环。 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。理论上扩增产物量成指数上升，既 n 个循环后，产量为 2n 拷贝。典型的 PCR操作过程如下：1、 反应体系：体积 成分 工作液浓度 终浓度14.0 l PCR Water 2.5
16、l 10X Taq Buffer 10X 1X 1.5 l MgCl2 25 mM 1.5 mM 4.0 l *dNTP Mix 1.25 mM each dNTP 0.2 mM each dNTP 0.25 l Primer 1 100 pmoles/ l 1 M 0.25 l Primer 2 100 pmoles/ l 1 M 0.25 l Taq DNA Polymerase 5 U/ l 0.05 U/ l 2.5 l DNA 25 l Total Reaction Volume （反应溶液可置于毛细管或薄壁离心管中扩增）2、操作过程：（所用仪器为 AMP1605热循环 PCR扩增仪预变性： 94 90 秒循环过程： 94 1 秒 48 1 秒 72 40 秒 40 个循环延伸： 72 5 分钟3、检测：琼脂糖电泳
