《婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定》由会员分享,可在线阅读,更多相关《婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定(6页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、GB 5413.162010 1 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定方法。 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本 适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。 3 原理 利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469 对叶酸的特异性,在含有叶酸的样品中生长产生 的酸度和形成的光密度来测定叶酸的含量。 4 试剂
2、和材料 除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 规定的二级水。 4.1 鸡胰腺: 称取 100 mg 干燥的鸡胰腺, 加 20 mL 蒸馏水, 搅拌 15 min, 离心 10 min (3000 转/分钟) , 取上清液,临用前配制。 4.2 0.9 %生理盐水:称取 9.0 g 氯化钠溶解于 1000 mL 水中,分装于具塞试管中,每管 10 mL,121 灭菌 15 min。每周准备一次。 4.3 磷酸盐缓冲液 4.3.1 磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L):称取 5.85 g 磷酸二氢钾,1.22 g 磷酸氢二钾,用 1000 mL 水溶 解。临用前按 0.
3、5 g/100 mL 加入抗坏血酸。 4.3.2 磷酸盐缓冲液(用于谷物及谷物制品前处理):称取 14.2 g 磷酸氢二钠,用 1000 mL 水溶解。 临用前按 1.0 g/100 mL 加入抗坏血酸,用氢氧化钠溶液 A(4.16)调 pH 至 7.80.1。 4.3.3 磷酸盐缓冲液 III(用于谷物及谷物制品测试):称取 14.2 g 磷酸氢二钠,用 1000 mL 水溶解。 临用前按 1.0 g/100 mL 加入抗坏血酸,用氢氧化钠溶液 A(4.16)调 pH 至 6.80.1。 4.3.4 磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L)(用于谷物及谷物制品标准溶液制备):溶解 13.61 g
4、磷酸二氢钾 于水中稀释到 1000 mL。用氢氧化钾溶液(4.10)调 pH 至 7.00.1。 4.4 叶酸标准品。 4.5 氨水(10.8 %)。 4.6 甲苯(C7H8)。 4.7 抗坏血酸(C6H8O6)。 4.8 菌株:干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469。 GB 5413.162010 2 4.9 培养基 4.9.1 乳酸杆菌琼脂培养基:胨化乳 15 g,酵母浸膏 5 g,葡萄糖 10 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2 g, 聚山梨糖单油酸酯 1 g, 琼脂 10 g, 加蒸馏水至 1000 mL, 调 pH 至 6.8 0.2 (20 2
5、5 ) 。 121 高压灭菌 15min,备用。 4.9.2 乳酸杆菌肉汤培养基:胨化乳 15 g,酵母浸膏 5 g,葡萄糖 10 g,番茄汁 100 mL,磷酸二氢钾 2 g,聚山梨糖单油酸酯 1 g,加蒸馏水至 1000 mL,调 pH 至 6.8 0.2(20 25 )。121高压灭 菌 15min,备用。 4.9.3 叶酸测定用培养基:酪蛋白胨 10 g,葡萄糖 40 g,乙酸钠 40 g,磷酸氢二钾 1 g,磷酸二氢钾 1 g,DL-色氨酸 0.2 g,L-天门冬氨酸 0.6 g,L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g,硫酸腺嘌呤 10 mg,盐酸鸟嘌呤 10 mg,尿嘧啶 10 mg,黄嘌
6、呤 20 mg,聚山梨糖 0.1 g,谷光甘肽 5 mg,硫酸镁 0.4 g,氯化钠 20 mg,硫 酸亚铁 20 mg,硫酸锰 15 mg,核黄素 1 mg,p-氨基苯甲酸 2 mg,维生素 B6 4mg,盐酸硫胺素 400 g, 泛酸钙 800 g,烟酸 800 g,生物素 20 g,加蒸馏水至 1000 mL,调 pH 至 6.7 0.1(20 25 )。 注:市售商业化合成培养基效果更稳定。 4.10 氢氧化钾溶液(4 mol/L):称取 224 g 氢氧化钾于 1000 mL 烧杯中,用 400 mL 水溶解,冷却至 室温后,转移至 1000 mL 容量瓶中,用水定容。 4.11 木
7、瓜蛋白酶溶液:1 g 蛋白酶(活力6000 U/mg,pH 6.0 0.1,40 )溶于 100 mL 磷酸盐缓冲 液(4.3.1)中。临用前配制。 4.12 -淀粉酶溶液:1 g -淀粉酶(1.5 U/mg)溶于 100 mL 磷酸盐缓冲液(4.3.1)中。临用前配制。 4.13 0.22 m 灭菌滤膜。 4.14 标准溶液的制备 4.14.1 叶酸标准贮备液(500 g/mL):称取 55 mg56 mg(精确至 0.1 mg)叶酸标准品(4.4),用 50 mL 蒸馏水转入 100 mL 容量瓶中,加 2 mL 氨水(4.5)。溶液制备后,按式(1)计算溶液的体积, 要求贮备液中叶酸盐的
8、浓度为 500 g/mL: 贮备液体积(mL)= 500100 1000 cm 或简化为: 贮备液体积(mL)= 50 cm (1) 式中: m叶酸标准品的质量,单位为毫克(mg) ; c叶酸标准品的纯度,单位为克每百克(g/100 g) 。 用水稀释溶液至刻度,用吸管加水至计算要求的体积,充分混合,放入棕色试剂瓶中 2 4 冰 箱冷藏,保存期为 4 个月。 4.14.2 叶酸标准中间液(50 g/mL):吸取 10 mL 叶酸标准贮备液(4.14.1)于 100 mL 棕色容量瓶 中,用水定容至刻度,充分混匀,2 4 冰箱冷藏,保存期为 1 个月。 4.14.3 叶酸标准工作液(0.05 n
9、g/mL,0.1 ng/mL):吸取 1 mL 叶酸标准中间液(4.14.2)于 100 mL 棕色容量瓶中,用水定容至刻度,混合。再吸该液 1 mL 于 100 mL 棕色容量瓶中,定容,混合。 从上 液中分别吸取 5 mL 于 250 mL 和 500 mL 棕色容量瓶中, 用磷酸盐缓冲液 (4.3.1) 定容到刻度, 混匀, 即为高浓度标准工作液(0.1 ng/mL)和低浓度标准工作液(0.05 ng/mL)。临用前配制。 4.15 盐酸(1 mol/L):量取 83.0 mL 盐酸溶于水中,冷却后定容至 1000 mL。 GB 5413.162010 3 4.16 氢氧化钠溶液 A(4
10、 mol/L):称取 160 g 氢氧化钠于 1000 mL 烧杯中,用 400 mL 水溶解,冷却 至室温后,转移至 1000 mL 容量瓶中,用水定容。 4.17 氢氧化钠溶液 B(0.1 mol/L):吸取 2.5 mL 氢氧化钠溶液 A(4.16)转移至 100 mL 容量瓶中用 水定容。 4.18 氢氧化钠标准滴定溶液(0.1 mol/L 0.0002 mol/L):称取 4 g(精确至 0.0001 g)氢氧化钠用水 稀释至 1000 mL,用邻苯二甲酸氢钾标定。保存此溶液的容器要密封,以防二氧化碳渗入。 4.18.1 氢氧化钠标准溶液的标定:称取约 0.18 g(精确至 0.00
11、01 g)于 105 110 烘至恒重的邻 苯二甲酸氢钾,用 50 mL 除二氧化碳的水溶于锥形瓶中,加两滴 5 g/L 的酚酞指示剂,用配好的氢氧化 钠溶液滴定至粉红色,同时作空白实验。按式(2)计算氢氧化钠标准溶液的浓度: c= 2042 . 0 )( m 21 VV (2) 式中: c氢氧化钠的浓度,单位为摩尔每升(mol/L) ; m称取的邻苯二甲酸氢钾的质量,单位为克(g) ; V1氢氧化钠溶液的用量,单位为毫升(mL) ; V2空白试验氢氧化钠溶液的用量,单位为毫升(mL) 。 4.18.2 酚酞溶液:取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 体积分数为 95 %的乙醇中,加入 20
12、mL 水,再加入氢氧 化钠溶液(4.18),直至加入一滴立即变成粉红色,再用水定容至 100 mL。 4.19 溴麝香草酚蓝指示剂:称取 0.1 g 溴麝香草酚蓝于研钵中,加入 1.6 mL 氢氧化钠溶液 B(4.17) 研磨,加少许水至完全溶解,转移至 250 mL 容量瓶中用水定容。 5 仪器和设备 5.1 pH 计:精度为 0.01。 5.2 离心机:转速2000 转/分钟。 5.3 分光光度仪。 5.4 天平:感量为 0.1 mg。 5.5 生化培养箱:36 1 5.6 滴定管:分刻度值为 0.1 mL。 5.7 涡旋振荡器。 6 分析步骤 6.1 测试菌液的制备 6.1.1 干酪乳杆
13、菌 (Lactobacillus casei) ATCC 7469 冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤培养基 (4.9.2) 中, 36 1 培养 24 h 后,转接至乳酸杆菌琼脂培养基(4.9.1)试管中,再 36 1 培养 24 h。培养好的 乳酸杆菌琼脂培养基(4.9.1)试管的培养物作为贮备菌种。 GB 5413.162010 4 6.1.2 从贮备菌种培养基上分别转接到三个乳酸杆菌琼脂培养基 (4.9.1) 试管中, 放入培养箱中 36 1 培养 24 h。每月转接一次,作为月接种管贮于冰箱中。每月定期从月接种管中重新接种 3 个转接管保 存新菌株。 6.1.3 从月接种的培养管中的一支再接种
14、一支乳酸杆菌琼脂培养基 (4.9.1) 试管, 36 1 培养 24 h, 作为日接种管每日测定用。 6.1.4 从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤培养基(4.9.2),36 1 培养 24 h。在无菌条件下离 心该培养液 10 min (2000 转/分钟) , 弃去上清液。 用 10 mL 生理盐水 (4.2) 振荡洗涤菌体, 离心 10 min (2000 转/分钟),弃去上清液,用 10 mL 生理盐水(4.2)振荡清洗。如前离心操作,弃去上清液。再 加 10 mL 生理盐水(4.2),混匀。吸 1 mL 该菌悬液于 10 mL 生理盐水(4.2)中,混匀制成测试菌液。 6.1.5 以生
15、理盐水(4.2)做对照,用分光光度计,于 550 nm 波长下,测测试菌液(6.1.4)的光密度 值,此值应在 60 %80 %之间。 6.2 试样的制备 6.2.1 乳制品 称取 2 g(精确至 0.0001 g)试样(约含叶酸 5 g)于 100 mL 烧杯中,用 25 mL30 mL 水复原样 品,转入 100 mL 容量瓶中,用水定容至刻度,溶液中叶酸的质量浓度大约为 0.05 g/mL。吸取 1 mL 该样液和 1 mL 鸡胰腺(4.1)于一个 180 mm15 mm 的带螺旋盖的试管中,充分混合。加 18 mL 含抗 坏血酸的磷酸缓冲液(4.3.1) ,再加 1 mL 甲苯(4.6
16、) 。同时制备空白对照管,吸 1 mL 蒸馏水和 1 mL 鸡胰腺(4.1)于空白管中,加 18 mL 含抗坏血酸的磷酸缓冲液(4.3.1)及 1 mL 甲苯(4.6) 。在 37 下,样品管和空白管保温 16 h 后,于 100 水浴加热 5 min。用磷酸盐缓冲液(4.3.1)作适当稀释, 得到浓度约为 0.1 ng/mL 的叶酸盐溶液。 若确定样品中强化叶酸与原生叶酸相比所占比例很大, 则可以用 1 mL 样液加 19 mL 含抗坏血酸的 磷酸缓冲液(4.3.1)于 100 水浴加热 5 min,再用磷酸盐缓冲液(4.3.1)稀释,得到浓度约为 0.1 ng/mL 的叶酸盐溶液。 6.2.2 谷物及谷物制品 称取大约含 1 g 叶酸的试样于 150 mL 三角烧瓶中。加 20 mL pH 7.8 磷酸缓冲溶液(4.3.2) ,混 匀后加 50 mL 水和 1.0 mL 甲苯(4.6