氨基酸发酵

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1、绪论氨基酸的用途： 食品工业 氨基酸在医药上的应用 饲料行业 化学工业 农业 化妆品氨基酸的生产方法：发酵法 提取法 酶法 合成法 氨基酸发酵：,就是以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物,积累特定的氨基酸。成功应用的一个重要原因氨基酸发酵工业：是利用发酵微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业 。研究目的：探讨氨基酸发酵工厂的生产技术。研究对象：生产过程、微生物生化问题、分析设备问题。学习任务：生产中的具体问题、育种问题、代谢控制问题、分离精制的原理方法、具有育种、探索新工艺、科研能力。第一章淀粉的特性 淀粉无还原性，无甜味，不溶解于冷水，酒精、醚等，相对密度 1.5,易沉淀。淀粉

2、遇碘变色与聚合度的关系：DP12 遇碘不呈现颜色变化12DP15 呈棕色20DP30 红色35DP40 紫色DP45 蓝色淀粉的水解谷氨酸发酵的水解糖液必需具备的条件1、 淀粉质量好，不能有霉变2、 淀粉浓度尽可能低3、 糖液中不含糊精4、 糖液要清，色泽要浅5、 糖液要新6、 蛋白质含量高时易产生泡沫7、水解糖的质量标准：色泽要浅黄色，透明，无糊精，还原糖 98%左右，DE 值 90%以上，透光率 60%以上，pH4.6-4.8 。淀粉的水解方法 酸解法 酸酶法 双酶法酸解法 工艺简单、水解时间短，生产效率高，设备周转快。 酸酶法 具有酸液化速度快的优点。糖化是由酶来完成的，因而可采用较高的

3、淀粉乳浓度，提高生产效率。用此法，酸用量少，产品颜色浅，糖液质量高。 双酶法 优点：（1）水解糖液纯度高，DE 值可达 98以上，使糖液得到充分利用。（2）反应条件较温和。（3）可以在较高的淀粉浓度下水解（4）可用粗原料。（5）双酶法制得的糖液颜色浅，较纯净，无苦味，质量高。（6）减少粮食消耗缺点：（1）酶反应时间长，生产周期长，夏天糖液容易变质（2）酶本身是蛋白质，引起糖液过滤困难。（3）要求设备较多，水解条件要求严格。从水解糖液的质量、原料利用率、糖收得率、耗能及对粗淀粉原料的适应情况来看，以酶解法最好，其次是酸酶法，酸法最差。从淀粉水解的整个过程所需的时间来看，酸法最短，酶法最长。第二章

4、谷氨酸的生物合成途径谷氨酸的生物合成包括酵解途径(EMP) 、磷酸戊糖途径(HMP 途径) 、三羧酸循环(TCA 循环)、乙醛酸循环、伍德沃克曼反应(CO2 固定反应等) 。生成谷氨酸的主要酶促反应1 谷氨酸脱氢酶(GHD)所催化的还原氨基化反应2 转氨酶(AT) 催化的转氨反应 3 谷氨酸合成酶(Gs)催化的反应谷氨酸发酵的代谢途径一、优先合成与反馈调节1、优先合成2、反馈调节反馈调节 谷氨酸脱氢酶(GDH)的调节 柠檬酸合成酶的调节 异柠檬酸脱氢酶的调节 -酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸产生菌中先天性地丧失或微弱。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节。二、糖代谢的调节1、能荷控制(细胞内的能量水平 )2生

5、物素对糖代谢的调节(1)生物素对糖代谢速度的影响生物素对糖代谢的影响主要是影响糖解速度。在生物素充足条件下，由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸，因而会引起乳酸的溢出。(2)生物素对 CO 2 固定反应的影响由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反应 由丙酮酸羧化酶催化的反应先由苹果酸酶所催化，进行还原羧化作用，生成苹果酸。然后再生成草酰乙酸：(3)生物素对乙醛酸循环的影响乙醛酸循环中关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。 异柠檬酸裂解酶催化的反应苹果酸合成酶催化的反应三、氮代谢的调节控制谷氨酸发酵的另外一个关键因素就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷

6、氨酸不去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成。生物素亚适量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时又由于完全氧化降低的结果，使 ATP 形成量减少，导致蛋白质合成活动停滞，在铵离子适量存在下，积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白质。 生物素充足时，异柠檬酸裂解酶的活性增强，琥珀酸氧化力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加。草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其它氨基酸量增加。谷氨酸发酵中的生物素问题生物素用量多少，将影响到谷氨酸的产量。它的影响大体可归纳为三方面：一、影响

7、糖降解的速度。二、改变发酵代谢方向。三、控制脂肪酸生物合成第一 控制细胞膜的渗透性的方法一、控制磷脂的合成，导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜a、生物素缺陷型（使用生物素缺陷型菌种进行生产的时候，必须控制生物素的用量）1作用机制生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰辅酶 A 羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的 1/2 左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。2控制的关键为了形成有利于谷氨酸向外渗透的磷脂合成不足的细胞膜，必须亚适量控制生物素（510微克/升）发酵初期（08 小时） ，菌体正常生长，菌体形态为单个、成对、八字形、

8、棒状、椭圆，短杆形。当生物素耗尽后，在菌体的再次倍增期间，开始出现异常形态的细胞，菌体伸长、膨大乃至不规则形，边缘有褶皱。完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。如果生物素过剩，就会出现只是长菌而不产酸的现象或者长菌好而产酸低。b添加表面活性剂（吐温 60）或者饱和脂肪酸使用生物素过量的糖蜜原料发酵生产谷氨酸时，通过添加表面活性剂或者高级饱和脂肪酸（C16-18）及其亲水聚醇酯类，同样能清除渗透屏障物，积累谷氨酸。1作用机制表面活性剂和饱和脂肪酸的作用，并不是在于他的表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为抗代谢物具有抑制作用，对生物素有拮抗作用。通过拮抗生物素的生物合成，导致磷

9、脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜。提高了细胞膜对脂肪酸的渗透性。2影响产酸的关键必须控制好添加表面活性剂、不饱和脂肪酸的时间与浓度，必须在药剂添加之后，在这些药剂存在下，再次进行菌的分裂增值。形成处于异常生理状态的产酸型细胞，即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。例如：以甜菜糖蜜为原料，采用高生物素、高吐温的工艺，一般发酵对数生长期的早期（46 小时） ，添加 0.2吐温 60 后 OD 值与菌体重约净增一倍。剩余生长太多，意味着谷氨酸生产菌的细胞不能完成有效的进行生理学变化；剩余生长不足，意味着谷氨酸生产菌没有机会完成这种转变。C.油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时

10、，必须限制发酵培养基中油酸的浓度1、作用机制由于油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力；即丧失了脂肪酸生物合成的能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性。通过控制油酸，使磷脂合成量减少到正常量的 1/2 左右时，细胞变形，谷氨酸分泌积累于培养液2控制的关键对油酸缺陷型突变株的谷氨酸生产力来说，最重要的因子是细胞内的油酸含量，必须控制油酸亚适量，而细胞内生物素、棕榈酸等饱和脂肪酸的含量多少却影响甚微。若油酸过量时，只长菌不产酸，或者长菌好而产酸低，只有在油酸亚适量的情况下，当油酸耗尽之后，谷氨酸菌经再度倍增，发生细胞膜结

11、构与功能上的特异性变化，除去谷氨酸向膜外渗透的障碍物，谷氨酸才能高产。d甘油缺陷型 使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，必须限制发酵培养基终甘油的浓度1作用机制甘油缺陷型的菌株丧失 -磷酸甘油脱氢酶，即丧失 L-甘油 3 磷酸 NADP 氧化还原酶。所以必能合成 -磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性直接关系的磷脂含量，使谷氨酸得以积累。2控制的关键使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵的生产时，为了高产谷氨酸，必须控制添加亚适量的甘油或甘油衍生物。这样，不管是用醋酸,还是糖质原料，不管添加还是不添加生物素、油酸、硫氨素等物质，都能高产谷氨酸。这是

12、由甘油缺陷型所控制的位置决定的。细胞内的磷脂可以由添加甘油的数量来调节，添加甘油过少，菌株生长不好，数量不够，周期长。甘油过量，磷脂合成正常，只长菌不产酸，或者长菌好产酸低；只有亚适量的控制甘油的时候，开始菌体正常生长，当甘油耗尽后，通过再度增殖，细胞变形。细胞磷脂的含量变为亲株的一半。压榨细胞的体积变小，从而破坏了细胞膜对谷氨酸的渗透屏障，使谷氨酸向膜外渗漏。二、阻碍谷氨酸菌细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜 例如，在发酵对数生长期的早期，添加青霉素或者头胞霉素 C 等抗生素1、作用机制添加青霉素是抑制谷氨酸生产菌细胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽转移酶，影响细胞壁糖

13、肽的合成。2、影响产酸的关键在生长的什么阶段添加青霉素是影响产酸的关键。必须要在增殖过程的适当时期添加，开始进入对数生长期的早期（3-6 小时）添加，添加青霉素的时间与浓度，因菌种、接种量、培养基的组成以及发酵条件的不同而不同。加入青霉素后，在菌体倍增期间，使新增殖的细胞没有充足的细胞壁合成，菌体形态急剧变化。多呈现伸张，膨润的菌型。完成由非积累型谷氨酸向积累型谷氨酸的转变。第三章 现有谷氨酸生产菌主要是棒杆菌、短杆菌、小杆菌及节杆菌。谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看，大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞 3 种不同时期的细胞形态。（1）发酵 08h 或

14、010h，为长菌型细胞。细胞形态与二级种子基个相似。这种细胞多为短杆至棒状，有的微呈弯曲状，细胞排列呈单个、成对及“V”字形。（2）发酵 818h 或 1020h 时为转移期细胞。此阶段细胞形状急剧变化，细胞开始伸长、膨大，在生物素贫乏的条件通过再度倍增，从谷氨酸非积累型细胞转变成谷氨酸积累型细胞。（3）发酵 1620h 以后为产酸型细胞。细胞为含磷脂不足的异常形态，呈现伸长、膨大、不规则，缺乏“V”字形排列，有的呈弯曲形，边缘颜色浅，稍模糊；有的边缘折绉乃至残缺不齐，但菌体形态基本清楚。在发酵后期，细胞呈现有明显横隔(13 个或更多) 的多节细胞，类似花生状，在产酸高，糖酸转化率高时尤甚日常

15、菌种工作1、定期分纯(一般 12 个月分纯一次 )2、小剂量诱变刺激（紫外线、通电、激光）3、高产菌制作安瓿管选育耐高渗透压菌株1.耐高糖选在 2030葡萄糖的平板上生长好的突变株。2耐高谷氨酸 选育在 1520味精的平板上生长好的突变株。3耐高糖、高谷氨酸选育在 20葡萄糖加 15味精的平板上生良好的突变株。选育细胞膜渗透性好的突变株1抗 V p 类衍生物抗 V p 类衍生物如香豆素、芦丁等能遗传性地改变细胞膜的渗透性。2选育溶菌酶敏感性突变株谷氨酸菌对溶菌酶都不敏感。用溶菌酶破壁时，首先用青霉素预处理后才能破壁。如果经诱变处理，使菌种对溶菌酶敏感，就使菌种的细胞壁网状结构变得较松散，细胞壁对细胞膜的保护作用降低，渗透性变大。3选育二氨基庚二酸缺陷型突变株二氨基庚二酸是谷氨酸菌细胞壁的组成成分，选育二氨基庚二酸缺陷型突变株，限量添加二氨基庚二酸，使细胞壁合成不完整，细胞壁对细胞膜的保护作用降低，渗透性变大。4选育温度敏感性突变株谷氨酸温度敏感型突变株的突变位置是发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱甚所置换，这样为基因所指导释放的酶，在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。当温度控制在最适生长温度(如30)时，菌体正常生长；当温度提高到一定程度时( 如 30 提高到 40) ，停止生长，而只产酸原生质体融合育种一般包括如下