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1、电泳仪器操作,主要内容,电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统和微波炉的作用，工作原理，操作关键技术，以及注意事项。,电泳原理,电泳的定义：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动的现象。电泳的基本原理：不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。电泳技术：利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 电泳的作用：主要用于蛋白质、核酸、同工酶、氨基酸、多肽等物质的分离；还可用于对分离物质的纯度和分子量的测定。,电泳的分类,根据电泳分子的大小分为：凝胶电泳：主要用于小蛋白质分子和核酸分子的分离毛细管电泳：主要用
2、于糖类和大蛋白分子的分离根据电泳方法，大致可分为3类：显微电泳自由界面电泳区带电泳：应用最广泛,电泳的分类,区带电泳按支持物的物理性状不同，可分为： (1）纸电泳：支持物为滤纸; (2）粉末电泳：如纤维素粉，淀粉，玻璃粉电泳； (3）凝胶电泳：如琼脂，琼脂糖，硅胶，淀粉胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳； (4）缘线电泳：如尼龙丝，人造丝电泳区带按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：(1）水平板电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式； (2）垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。 (3）柱状（管状）电泳：聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳。,电泳的分类,根据蛋白质分离的目的分为：单
3、向电泳：只在聚丙烯酰胺凝胶上分离。适于分离种类较少的蛋白。双向电泳：第一向使用预制胶条进行蛋白质的等电聚焦分离，第二向将胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质的分子量大小与第一向相垂直分离。用于蛋白质的分离，可将提取的蛋白质混合物中数千种蛋白质同时分离开。,单向与双向电泳条带比较,单向电泳条带,双向电泳条带,电泳实验过程,水平板电泳：制胶插试样格（梳子）取试样格点样电泳染色凝胶成像（对电泳结果进行观察记录和分析）。垂直板电泳： 连续电泳：直接灌分离胶配制凝胶溶液灌胶 不连续电泳：灌分离胶浓缩胶插试样格取试样格点样电泳染色脱色成像观察和记录。,仪器一、电泳仪,作用：在电泳
4、中提供电压与电流。1、电泳仪的分类 根据电泳仪的电压范围可将电泳仪分为3类：（1）常压电泳仪（600V）：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；（2）高压电泳仪（3000V）：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；（3）超高压电泳仪（30005000V）：用于毛细管电泳。 根据控制程序分为： 单恒（恒压）、双恒（恒流和恒压）、三恒（恒流、恒压、恒功率）。 (不论是单恒、双恒、还是三恒，仪器工作时任何情况下只能稳U、I、P中的一种参数)。,毛细管电泳仪,超高压电泳仪（高效毛细管电泳仪),常压电泳仪,高压电泳仪,梯度电泳仪(用于土壤微生物的分离）,生物分析仪（微流控芯片电泳仪）,2、操作方
5、法 这里以我们实验室常用的北京六一仪器厂生产的DYY-12型电脑三恒多用电泳仪为例说明。 U、I、P的有效输入范围： U：4-1000v（常压电泳仪） I： 4-500mA P：4-300w 可以同时连接4组电泳槽（并联），此时应选择稳压输出，当接多个电泳槽时，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和。,电极插座,（1） 设置工作程序 方法有三种： 用键盘输入新的工作程序，主要使用该方法（见后边介绍）。 按读取 键，取出保存在0中的上次工作程序，然后按确认键。（该电泳仪默认保存上次程序） 按读取、 0-9、确定键，取出保存在(0-9)中的工作程序。取出保存的程序，必须检查一遍，确认无误后才可启动仪器
6、工作。,（2）按键操作,A、模式键用于选择设置工作模式。每按一下模式键，其工作方式按下列顺序改变：STD（标准） TIME(定时) VH(伏时) STEP(分步) 标准模式到时不关输出，只是蜂鸣提示，需人工关机； 定时模式到时关输出； 伏时模式输出电压与工作时间的乘积达到设定值时关输出； 分步模式输出按步（-）及模式（定时或伏时）分别设定及执行。 通常使用标准模式和定时模式。B、选择键用于选择设置U、I、P、T的参数设置时先看U是否为反显状态，每按一次移到下一个参数，移动顺序为：U= I= P= T=,C、清除键：可以清除有反显提示的参数数值。如果输入错误，可以按清除键，再重新输入。D、启动键
7、：确认参数无误后，启动电泳仪输出程序。E、 +键：在输出情况下递增反显U、I、P、T的数值；每按一次递增一个数字，弱按住不放，则连续快速递增。F、-键：在输出情况下递减反显U、I、P、T的数值；每按一次递减一个数字，弱按住不放，则连续快速递减。G、继续键：当电泳过程中出现人为中断停机，并希望继续接着输出工作，可以按继续键，此后电泳仪接着前面的工作时间继续工作。工作结束时，仪器显示“End”，并连续蜂鸣提示，此时可按任意键止闹。关掉电源，拔出电源连接线。,（3）电源参数设定原则,稳定电压时，首先将电压的准确数值输入进去，其它电流或功率值要高于正常工作值，否则电压不能稳恒定。稳定电流时，首先将电流
8、的准确数值输入进去，其它电压或功率值要高于正常工作值，否则电流不能恒定。稳定功率时，首先将准确的数字输进去，其它电压电流值要高于正常工作值，否则功率不能恒定。一般预置电压或电流值要在工作电压或电流值的基础上加30，通常1v电压0.35mA工作电流，1mA3.5V工作电压，实际工作功率工作电压工作电流。例如：恒定电压为200v，预设电流100mA（工作电流+30mA），通常V电压0.35mA工作电流，200V电压预计工作电流为70mA，电流再向上加30mA=100mA。,显示屏,V： 0 v u=100v Mode: STDI： 0 mA I=50mA W： 0 w p=50w T: 00:00
9、 T=1:00 ,实际工作值,设置参数,3、电泳仪使用注意事项严禁将电泳槽放在电泳仪顶部，避免缓冲液洒进仪器内部。电泳前，禁止将电泳槽附带的电源导线连接到电泳仪电源上。勿用有机溶剂清洁面板。本仪器工作时电压较高，使用中应避免接触输出回路及电泳槽内部，以免发生危险。,仪器二、电泳槽,常用电泳槽分为水平板和垂直板两种。1、电泳槽的作用 水平板电泳槽主要用于大分子量的核酸和蛋白质的鉴定、分离和制备，还可测定核酸的分子量。 垂直板电泳槽主要用于小分子量的核酸和蛋白质分离、纯化及检测；还可进行双向电泳的第二向。这里我们以常用的水平板电泳槽为例讲解使用方法。,水平电泳槽,电泳槽种类,垂直电泳槽,电泳槽种类
10、,电泳槽种类,柱状电泳槽,2、水平板电泳槽主要结构 主要由装有铂丝电极和缓冲液的主槽、凝胶托盘、试样格（梳子）、挡板与电泳导线组成。3、水平板电泳槽（DYCP-33A型）使用方法先把凝胶托盘放在平台上，把挡板插入槽中。将融化的琼脂糖溶液冷至 55 ，用少量琼脂糖凝胶将玻璃板封边，放置样品梳。接着将融化的琼脂糖凝胶溶液不间断地倒在模子中（厚度依样品浓度而定，须注意避免气泡混入） , 室温下自然凝固。,待凝胶聚合后，轻轻拔掉挡板和梳子。注意先拔一侧，垂直拔出会使胶孔产生真空，导致部分凝胶被带出。把凝胶托盘移入电泳槽，加入缓冲液，使凝胶全部被浸没。（注意：加样孔靠近负极一端）在梳井内加样，注意避免引
11、入气泡；枪头不能插入太深，防止穿透胶块。盖好上盖，连接电泳仪电源与电泳槽之间的电泳导线。注意不要接错正负极，检查无误后接通电泳仪电源。根据凝胶板的薄厚选择适宜的电压与电流。,当溴酚蓝指示剂前沿到达胶的底部3/4处时停止电泳。电泳实验结束先关闭电泳仪电源；随之拔除电泳导线，然后打开泳槽上盖，取出凝胶托盘。将凝胶移至染色区的通风橱内用EB染色液染色1020分钟，然后将胶片转移至冲洗盘，冲洗掉多余的EB染色液，再转移到海绵上，进行两次彻底的吸水，直至胶片上没有水痕时，用保鲜膜包裹胶片，转移至凝胶成像仪中进行凝胶成像。,4、水平板电泳中常见问题与注意事项染色必须在电泳结束后，在染色区进行，禁止在电泳槽
12、内加EB染色液。 分不清正负极，导致样品跑到缓冲液中。红色为正级、黑色为负极，样品从负极跑向正极，加样孔靠近负极一端。加样时枪头不能插入太深，防止穿透胶块，刚刚插入即可。制胶浓度必须根据marker要求的浓度制备，否则小分子物质很容易跑出胶块。在没有经验的情况下，最好设置定时，否则由于疏忽样品就可能跑出胶外。缓冲液问题。样品必须完全溶解于上样缓冲液中（TE），否则不能在凝胶中移动；制胶和实际电泳采用同种缓冲液（TAE）；缓冲液加到凝胶上之后才能点样。,垂直电泳整个操作过程 制胶灌胶（不连续电泳：灌分离胶加蒸馏水灌浓缩胶）插入试样格加缓冲液（上、下两部分）拔掉试样格加样品盖上盖子，接通电泳仪电源
13、染色脱色。,JY-SCZ8型垂直板电泳槽使用方法,1、使用去污剂将凝胶玻璃板反复擦洗晒干，再用无水乙醇擦净表面。2、制胶时，首先挑选适合凝胶厚度的电泳玻璃，采取凹形玻璃板（简称凹板）在内芯内侧、矩形玻璃板（简称平板）在内芯外侧的方向，顺着内芯一侧的紧固侧板小心放入。特别注意 如果将凹板和平板的方向装反（平板在内，凹板在外），将无法直接电泳，需要再次移动玻璃。3、选择平整操作台面（建议在玻璃板上操作），当玻璃放入内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与台面对齐，再拧紧紧固旋钮。特别注意 使凹板、平板的底部边缘均与桌子上的玻璃台面对齐是密封的重要条件。如果是初学者，建议在拧紧紧固旋钮后将内芯翻转过来，便
14、于用眼睛观察或者用手的触摸检查是否平齐。,4、将装好玻璃板的内芯，安装在制胶底座上，压紧吊扣。5、将配制好的分离胶溶液，缓慢向凝胶腔内注入，注意不要产生气泡。6、分离胶灌完后，用滴管在分离胶表面轻轻注入一层正丁醇溶液或蒸馏水以保证分离胶的无氧聚合。7、当分离胶聚合后，倒出表面的正丁醇溶液或蒸馏水，并用吸纸吸干。8、在分离胶表面注入浓缩胶，注入高度距凹板下沿2-3mm或与之平齐。 9、向凝胶内插入相应的加样梳。 特别注意在灌胶时无论是灌分离胶或是浓缩胶，在凝胶没有聚合时不要移动制胶器，以确保凝胶表面的平整，保证最终的电泳效果。10、当凝胶聚合后，取出梳子，打开搭钩，从制胶器中取出内芯，放入电泳槽
15、底槽中，制胶过程结束。,注意事项1、组装玻璃板。在组装玻璃板时，下部的两个螺栓不要拧得过紧，只要使玻璃板与铝板充分接触即可。2、分离胶浓度的选择。低浓度胶对大分子量蛋白质分离效果好；高浓度胶对小分子量蛋白质分离效果好。3、TEMED的加入量。TEMED是促进聚丙烯酰胺聚合的加速剂。加速效果随试剂保存时间而变化。对于陈旧试剂，可适当多加。事实上，配制分离胶时每块胶板按2滴加入，效果也不错。4、电极缓冲液的配制。电极缓冲液的用量大、占体积、配制麻烦。如果经常跑胶，可考虑配制5X浓度的浓缩液。方法如下：将144g甘氨酸和30.2g Tris溶于1升蒸馏水中。使用时稀释5倍。5、丙烯酰胺的毒性。丙烯酰胺和甲叉夹双丙烯酰胺都是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用。但在聚合形成凝胶后毒性降低，在胶体没凝固时不要乱倒胶液，应待凝固后放入垃圾桶。操作时应戴橡胶或塑料手套，尽量避免接触皮肤，并注意实验后洗手。6、保养铝板。每次使用完后应及时清理、擦拭，尤其是铝板的表面，为防止长时间污垢堆积不能与玻璃板充分接触，以降低恒温效果。7、本品为易碎品，在搬运过程中应注意轻拿轻放。,
