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1、液相色谱柱的应用,高效液相色谱培训系列,1,目 录,一、液相色谱分离原理,二、液相色谱柱的结构,三、液相色谱柱的选择,四、色谱柱的使用,五、 分析条件的影响,六、色谱柱的维护,2,一、 HPLC分离原理,样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分在流动相和固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件),3,分配过程,4,分配系数 - K,K= K= 常数 （T恒定） Cm =组分在流动相中的浓度 Cs = 组分在固定相中的浓度,5,容量因子k,是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。
2、 在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数 容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。 k = Ms / Mm Ms为组分在固定相中的质量， Mm为组分在流动相中的质量,由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k,6,色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标,7,色谱理论：速率理论-影响柱效的因素,速率理论是荷兰学者范弟姆特于1956年提出的, 表述了影响柱效的因素及提高柱效的多种途径，其核心是速率方程（也称范弟姆特方程式）。 速率方程H = A + B/u +Cu H：理论塔板高度； u：流动相的线速度,8,色谱理
3、论：速率理论-影响柱效的因素,H = A + B/u +Cu,9,色谱理论：分离度,分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均峰宽之比。 R=2（TR2-TR1）/（W2+W1） 计算表明： 1：R0.8时，两组分不能完全分离 2：R=1时，两组分峰重叠约2% 3：R=1.5时，两组分峰完全分离。 R值越大分离越好，反之则峰重叠愈多。 降低柱温、增加柱长可使R提高。,10,样品组分的分离,11,液相色谱的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,泵输液,分离,检测,记录,进样阀,进样,12,HPG-3x00RS 泵 在整个流速范围下保持800 bar高压 最高流速达到5 ml/min WPS-30
4、00RS 自动进样器 进样周期15 秒 进样阀耐压1000 bar TCC-3000RS 柱温箱 5-110 C 温度范围 柱后冷却 DAD-3000RS检测器 全波长扫描范围数据采集速率100 Hz Acclaim 2 m色谱柱 耐压800 bar Chromeleon CMS软件及时获得结果,UltiMate 3000 RSLC 快速分离液相,17/12/2020,13,13,高性能UltiMate 3000 x2 三元梯度系统,有六通道脱气机的溶剂架,独特的双梯度泵：两个三元梯度泵封装在一个机箱内,带温控选项的自动进样器,独特的柱温箱可放置两个柱切换阀,可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测
5、器,14,液相色谱柱的应用,二、色谱柱的结构和安装,15,色谱柱的构造,.色谱柱管 常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使用HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化的氧化物涂层。 色谱柱规格 内径：常用4.6mm，2.1mm 柱长：常用50，100，150，250cm,16,色谱柱的构造,色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是螺纹组件连接，中间放置压环用于密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到
6、底，然后再拧紧空心螺钉。,17,色谱柱子的构造,不同厂家和型号的柱 子会有一定的差别,18,液相色谱柱的构造,在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。,19,色谱柱的构造,柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用颗粒粒径在310 m的范围内。 正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是硅胶表面键合CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
7、 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、 -NH2、苯基等。,20,液相色谱柱的安装,色谱柱的安装： 拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。,21,液相色谱柱的安装,按柱管上标示的流动相流向， (如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的链接管。 连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。 如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧14圈，直至不漏液为止。,
8、22,连接接管必须注意：,23,色谱连接注意事项,1.尽量减少死体积,24,连接管线与接头,0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中2.1内径色谱柱 0.17mm内径管线用于分析型HPLC中2.14.6内径色谱柱 0.25mm内径管线用于半制备型HPLC中9.4内径色谱柱 0. 5mm内径管线用于制备型HPLC中21.2内径色谱柱,50 mL 柱外体积（管线）,样品: 1. 苯丙胺酸 2. 5-苯基-3, 6-二氧-2-哌嗪乙酸 3. Asp-Phe 4. 天冬甜素,色谱柱: StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm, 3.5 mm 流动相: 85% H2O with 0.
9、1% 三氟乙酸 : 15% ACN 流速: 1.0 mL/min 温度: 35C,25,液相色谱柱的应用,三、液相色谱柱的选择,26,分离模式的选择,样 品,溶于有机溶剂,溶于水,溶于四氢呋喃,非离子化,离子化,溶于有机溶剂,溶于水,溶于正己烷,溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水,用键合相的反相模式,用键合相的反相模式,低分子凝胶渗透色谱,用键合相的反相模式,抑制电离反相键合相色谱,用硅胶的正相模式,离子交换模式,凝胶渗透色谱,凝胶过滤色谱,大孔填料的离子交换模式,用大孔填料的反相模式,分子量2000,分子量2000,低分子凝胶渗透色,用硅胶的正相模式,用键合相的正相模式,27,1.填料：硅
10、胶、氧化铝、聚苯乙烯等 2. 键合相： C4、C8、C18、苯基、氨基等（封端技术） 3.孔径：60-100A 分子量2000 4.粒径：2um-10um 5.内径：10mm以下（分析），10mm以上（制备） 6.长度：10、15、25、30mm,柱子的选择,28,正相 99.995% 纯度的二氧化硅,39,A型、B型硅胶比较,A型硅胶 化合物 被吸收,B型硅胶 峰型峰高 分离正常,40,金属敏感测试,色谱柱 Diamonsil（钻石）C18 5um，150 x 4.6mm 流动相 CH3CN / Water (50:50) 流速 1.0 mL/min 检测 UV230nm 硅胶中如果存在金属
11、杂质，将与2,3- 二羟基萘（峰2）形成金属螯合物，保留时间延长并导致峰形拖尾。2,7- 二羟基萘（峰1）不与金属作用并作为内标物。,41,色谱柱子的尺寸,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响： 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) 运行时间长，分离度高 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 宽径柱 (3-23mm) - 载样量高,42,颗粒形状与大小,颗粒形状：1 球形 2 无定形,球形,粒径 - 对色谱分离的影响 较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5m粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5m的粒径,1.8m 3
12、.5m 5m 7m 10m,43,填料粒度,商品化的填料从 2m 30m 目前常用于分析 3m ,5m ,10m 用于半制备 10m ,15m 用于制备 15m 30m 3 m 填料,44,粒径的影响,N,Flow,3 m 5 m 10 m,45,粒径与柱效,46,核壳U-HPLC的科学原理,美国Advanced Material Technology Inc. Kirkland博士发明 。 内核1.7 um, 因此柱效至少相当于UPLC; 外层0.5um, 总粒径2.7um, 因此色谱柱压力接近3.0um色谱柱 。,47,流速设定,48,色谱柱尺寸和填料粒径的影响,1. C18 4.6*25
13、0,5um;242nm,甲醇15%60%(45min),2. C18 4.6*150,3.5um;242nm,甲醇15%60%(25min),3. C18 4.6*50,3.5um;242nm,甲醇15%60%(10min),49,比表面积与孔径,表面积 - 对色谱分离的影响 高比表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力、柱容量和分离度. 比表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要,孔径 - 对色谱分离的影响 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 样品 MW 2, 000, 选择 100 的孔径 样品 MW 2, 000, 选
14、择 300 的孔径,50,比表面积的比较,51,比表面积与孔径的影响,52,大孔径填料适用于大分子分析,大孔径300 全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽,色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔, 与孔内表面的键合相进行分离分配,53,300 孔径可改善蛋白质和多肽峰形,选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形,54,300 孔径可改善大分子的峰形,色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸 流速: 0.75 mL/min 温度: RT 检测器: UV 282 nm,溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 窄的峰宽表明待测分
15、子进入填料孔没有受到阻碍,分子量虽小但 体积较大的分子,55,色谱柱化学性质,键合类型 单齿键合 - 键合相分子与基体单点相连 双齿键合 - 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量 封端 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,56,键合类型,键合类型对色谱分离的影响 ： 单齿键合： 提高传质速率, 加快色谱柱平衡 双齿键合： 增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载样量,57,碳载量,碳载量是指固定相中碳的含量 不同的键合相有不同的键合密度，并决定固定相的本质。 一般C18、C18的碳载量为10%14%，高的可达18%20%,58,碳载量,碳载量- 对色谱分离的影响 高碳载量：保留强，提高分辨率,分析时间长 低碳载量：保留弱，缩短运行时间,59,碳载量,60,封端技术,封端 - 对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品和碱性样品，未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,61,固定相键合 二甲基硅烷,封端 四甲基硅烷,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,R = C8,C18,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si,R,
