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1、ELISA 设置阴性、阳性、空白对照涉及实验结果有效性评价一ELISA 试验有效性与三项对照什么是“有效性”（Validity）？要获得准确的检测结果“有效性”评价，就会关系到：为什么要设置“阴性、阳性和空白”等不可缺少的三项对照？要用什么样的物质担当“阴性、阳性和空白对照（品）”？这“三项对照”如何设置、需要设置几个孔位？获得的测定值如何“认可、取舍与计算”？随后，又如何依照阳性对照均值（PCx）与阴性对照均值（NCx）的差值（P-N，或 N-P）大小做出“试验结果有效性”的最终裁决呢？等等，这一连串的问题，在国外“正规”品牌的 ELISA 试剂使用说明书中都有明细和详尽的说明。既有理论要点
2、提示，又有具体细致的举例解说。很可惜，在 90 年前后，国内兴起ELISA 检测热潮之际，在一片“国外试剂说明书太详细、太复杂、不容易看明白、”等等“一片埋冤”声中，正好迎合国内商家的“意愿”。从此以后，国产 ELISA 试剂的说明书，越来越简单。这其中商家就有两个“好处”：好处之一，用 A4、或 B5，甚至比 B5 还要小的一张纸，代替国际试剂的好几页的“使用说明书”（等同于一份“操作手册”），每年就可节省一大笔印刷成本费；好处之二，如同国际试剂说明书上向用户交待的各种表明本试剂质量有关的详尽内容，国产试剂的所谓“说明书”上统统可以“删除、回避、拒绝”向用户通报和承诺。我 90 年前后收集的
3、雅培、巴斯德、阿克苏等相关试剂的原文说明书，几经搬动全都处理，很是可惜。近日，杭州检疫局朋友送了一份生物梅里埃中国有限公司的中文版人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）使用说明书。对照阅读之下，深深感到这才是一份真正意义上的使用说明书呀！在我下文提到的若干“概念、问题”，从中都可以找到答案。我现在参照我本人 1993 年的肝炎 ELISA 试剂质量与检测结果有效性评价会议讲稿相关内容，就“三项对照与检测结果有效性”表示如下认识和讨论。二三项对照要求与用途 ELISA 检测，按照试剂说明书要求，每次试验、每块扳上都要设置以下 3 项对照和用途： 5ZJ8Yh 1空白对照：仅用稀释液代替
4、检测样本、用以观测最终反应的显色“本底”、并用于酶标仪消除、扣除“本底”，即：以本底为“零”读取阳性、阴性对照孔和样本检测孔的吸光值（A）；或者，在计算阴性对照均值（NCx）、阳性对照均值（PCx）、样本读数的 S/C.O.值时减去空白对照的本底吸光值。早年的酶标仪无自动扣除空白对照孔读数功能，这种酶标议现已淘汰不用了，写上这段话的意思是补充说明设置空白对照的用途。空白孔具体如何读取读数，则依照说明书操作。例如，生物梅里埃中国有限公司的中文版人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）使用说明书上提示：以空气读空白（不放板架和板条），在 450nm（单波长）、或 450nm 和 62070
5、0mn（底物是TMB）参考波长进行读数。 2阴性对照（品）： o74 jAA （1）阴性对照（品）的概念与要求：所谓阴性对照（品），应当是本项检测试验中采用与待捡物（样品、人用试剂就是人的血清等）具有同源性和同质性，又不含有待检物质，并能客观比较和鉴别处理因素（血清免疫学试验中有特异性抗原与抗体反应）之间的差异。因此，用动物血清或其制品（如牛血清白蛋白等）代替阴性人血清作为对照品，从理论和实践上都是不可取的，弊端甚多，无须细述。注意：据我所知，国产 ELISA 试剂中，有的厂牌是用动物血清制品稀释配置、或与部分人血清混合配置的；其二，阴性对照读数，并非是“越低越好”。NCx 值接近 0.00X
6、 水平，这是假象！试想一下，真正采用“阴性人血清”的阴性对照品，NCx 值会如此之低吗？举个例子，雅培乙肝六项 EIA 试剂的 NCx 值，分别为：0.010（HBsAg）、0.027（抗HBs）、0.035（HBeAg）、1.083（抗HBe）、1.065（抗HBc）、0.045（抗 HBc-IgM）。生物梅里埃的HIV 试剂 NCx 是 0.091。辨别试剂 NCx 值是否合理的一个很简单的方法，只要对比大量阴性样本的实际读数就“一目了然”啦！ vx /cX$ 一个题外插曲：表明 ELISA 试剂内在质量的一个重要统计标志，就是要看：阴性样本的的上限不应当大于、必须小于 C.O.I.=1.
7、00；反之，阳性样本的的下限不可小于、应当大于 C.O.I.=1.00！早年我用 SPSS 软件输出阿克苏 HIV 和国产甲、乙试剂检测 600 例左右的健康人体检血清的三幅直方图，可以表明阴性样本的不同分布特征，颇有意思。我为什么要如此细说 NCx 呢？因为 NCx 值在Cut off 值计算中是相当举足轻重的（详后）。 pPLOCBh （2）阴性对照（品）分为两类 )i （2）阳性对照（品）设置，也可区分为两种类型与用途： P+|;Cp/)8 一是阳性对照主要用于评价该项试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性。而所设的阳性对照的测量值不列入 Cut off 值计算、但是不可不做。如HB
8、sAg、抗HBs、HBeAg 等。 Z%) 0Rj 二是阳性对照的设置，不仅用于评价试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性，而且计入 Cut off 的计算。此时的 Cut off 值的含义是代表该标志物在健康（正常）人群中正常值范围的上限。待检样本检测值超过该上限（Cut off）时表示有诊断意义。例如抗HBe、抗HBc、抗HBc IgM 等。 ) W?m:t 三阴性与阳性对照平均值计算与判断 fys!c - 1阴性对照平均值 NCx 有效性计算判断举例： A3a1 （1）第一类 NCx 计算与评价：以 HBsAg 为例 4/ 5dgB巴斯德 HBsAg EIA Kit。 （2）第二类
9、NCx 计算与评价：可包括抗 HBc、抗HBe。以抗HBc、抗HBe 为例： :=Jj=;Z . 取 3 孔阴性对照 A 值的平均值： Ke(Tq 抗HBc NCx=（1.027+0.989+1.278）/3=1.065 zf#v5=$ 抗HBe NCx=（1.169+1.088+0.993）/3=1.083； %rCGTS4D 请各位注意：这 2 个 NCx 是不是很接近 1.00 呀？也就是说，十分接近C.O.I.（C.O./S，或 C.O./A）=1.00！这不是一种偶然，而是国际试剂（如雅培）的“质量”标志。如果偏大，例如 1.50 以上，或者偏小，0.50 以下，待检样本中会导致出现
10、什么现象呢？请读者自己思考吧。 /sjpI . 各孔 NC 值均应2.000，并处于0.5NCx 至1.5NCx 之间。若其中 1孔 NC 值偏离该范围时，弃去，再计算 2 孔的 NC 值的 NCx。如有 2 孔 NC 值偏离该范围时，应重新试验。 2阳性对照平均值 PCx 有效性计算与评价也分为两类： !ebD/5 （1）第一类 PCx 计算与评价：以 HBsAg 为例 DauI*sZmR . 第一类 PCx 的计算不列入 Cut off 计算，可取（设）23 孔阳性对照的平均值 PCx（Abbott）： PCx=（1.024+1.030）/2=1.027。注意：本例雅培试剂HBsAg 的
11、Cutoff 值=NCx+0.05=0.06，PCx 的 S/C.O.=1.027/0.06=17.12。如果S/C.O.超过 20.00 以上，提示 HBsAg 阳性对照含量太高！PR%pk-# . 参照方法学的要求，也可规定 PCx 应1.000（指 A 值），而且各孔 PC 值要求0.5PCx 至1.5PCx 7Ov/C . PC 的设置及 PCx 的计算，主要用于评价本次试验结果是否有效和各批/次试验结果的稳定性和可比性，并不参与 Cut off 值的计算。同一个批号试剂及其阳性对照品在规定保存条件和有效期内，各次试验时 PCx 值也应保持相对稳定水平。换句话说，实验结果有效性评价时，
12、也应观测阳性对照的“统计过程控制”（SPC）处于稳定状态输出“控制图”。 （2）第二类 PCx 的计算与评价：也以抗HBc 为例 (1 ;g!7A . 可取（设）23 孔 PC 的 A 值得平均值 PCx： PCx=（0.051+0.038）/2=0.045 . 参照方法学要求，也可规定各孔 PC 值应处于0.5PCx 至1.5PCx 范围内。 GnhSE; . PCx 值参与 Cut off 值的计算，例如抗HBc 的 Cut off（Abbott）： zB m6Cut off=0.4（NCx）+0.6（PCx）。fX(Ux l 该值（Cut off）可以理解为：指示性定量 HBcAg 反应
13、值的 40%加定量抗HBc反应值的 60%之和，恰为健康人群血中抗HBc 正常值范围的界限。任一待检样本的检出值低于该 Cut off 值时则判为抗HBc 阳性，大于该 Cut off 值时则判为抗HBc 阴性。 3计算 NCx、PCx 有效性与统计控制应用 *s3f*+s5 读者如果注意到 NCx 与 PCx 有效性计算规则，很有点像电视上的“去掉一个最小值、去掉一个最大值”的评分办法，就知道统计学上的异常值“粗略”取舍法，把 3 个对照值中的 1 个最小、或最大“异常值”剔除，再重新计算余下的2 个对照值的平均值。这样，不但可以比较前、后试验的各次反应板之间的 NCx与 PCx 的波动状态
14、，用这样的 NCx、PCx 去绘制控制图，也可以减少因为含有异常值的平均值造成的“假失控”机率。况且，无论是单值控制图、或是均值控制图，质控数据中是不应当含有“异常值”数据的。 2T6= 4ELISA 试验统计控制如何借鉴 PCx 有效性计算与应用，拟在另文中讨论。!) 8 四计算 P-N 与 N-P 差值的意义用途 I,aMugDWs 1国际品牌的 EIA 试剂，很注重观测阳性与阴性（P-N）、或阴性与阳性（N-P）对照均值之间的差值，以及 P/N（或 N/P）比值与 C.O.I.指数的比较，并把它视为：在评价试剂质量或判断试验结果有效性时是不可或缺的评价指标。我用雅培的 EIA 乙肝试剂为
15、例列表如下（见附表 41）： T8/G,;1y附表 41 HBsAg（a、b、d 法）抗HBsHBeAg 抗HBe 抗HBc 抗HBc-IgM Gu1LhI CutoffNCx+0.05NCx+0.05NCx+0.060.5(NCx)+0.5(PCx)0.4(NCx)+0.6(PCx) 0.25(PCx)+NCx fMg5gT- P-N 或 N-P0.4000.3000.3000.3000.3000.300 r,23-d$h 1.027-0.010=1.0171.447-0.027=1.4201.202-0.035=1.1671.083-0.040=1.0431.065-0.0481.0170
16、.846-0.045=0.801 a?mZ_yyF P/N（或 N/P）与 A/C.O.（或 C.O./A）比较P/N=1.027/0.01=102.7A/C.O.=1.027/0.06=17.121.447/0.027=53.591.447/0.077=18.791.167/0.2533.341.167/0.095=12.28N/P=1.083/0.040=27.08C.O./A=0.562/0.01=14.051.065/0.045=23.670.453/0.045=10.07P/N=0.846/0.045=18.8A/C.O.=0.846/0.257=3.29 j7|U9S/ =D 例如：HBsA
