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1、1,第二章 微生物发酵制药工艺,2,第一节 概述,3,发酵：通过微生物培养而获得产物的过程 微生物发酵制药：利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产,一、发酵,发酵工程的4个阶段,第一阶段 1676年制成第一台显微镜 微生物的存在 1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的 1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精酶,第二阶段 对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食
2、品。,第三阶段 20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素迅速工业大规摸生产。 深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。,7,发酵罐发酵,8,立式,卧式,摇床发酵,9,静置发酵,10,二、,初级代谢产物： 与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的 氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累,次级代谢产物： 与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成 抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等 结构常较复杂对环境条件敏感,三、常见的制药用微生物,细菌 放线菌 真菌,细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli),生产天
3、冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物 基因工程的载体,细菌之短杆菌属(Brevibacterium),维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。,细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium),生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌， 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542,细菌之芽孢杆菌属(Bacillus),生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用于甾体转化等。,细菌之假单胞菌属 (Pseudomonas),生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类； 进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞
4、蛋白。,细菌之乳酸杆菌属 (Lactobacillus),生产抗癌类药物,放线菌,抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。,放线菌之链霉菌属 ( Streptomyces ),灰色链霉菌(Streptomyces griseus) 产链霉素 金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 产金霉素 红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 产红霉素 龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus) 产土霉素,放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia),生产利福霉素、蚊霉素等,放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora),多种
5、可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora)产庆大霉素。,放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes）,典型代表：济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964),真菌之根霉属(Rhizopus),生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。,真菌之曲霉属(Aspergillus),生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。,真菌之青霉属(Penicillum),产黄青霉(Penicillum chrysogenum) 生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸,真菌之头孢霉菌属(Ce
6、phalosporium),产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、 顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium) 都生产头孢菌素C,真菌之酵母菌属(Saccharomyces),啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)：生产啤酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。 红酵母 (Rhodotorula)：-胡萝卜素 棉病针孢酵母(Nematspora gossypii)：核黄素,真菌之其它,牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、胆碱和腐胺等生物碱。 灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、1
7、6种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。,30,菌株选育、发酵和分离纯化或提炼是发酵制药的三个主要工段。,四、发酵制药的基本过程,31,发酵制药流程,32,发酵制药工艺,33,菌体生长与产物合成的三个阶段： 发酵前期（fermentation prophase) 菌体生长期（cell growth phase) 发酵中期(fermentation metphase) 产物合成期（product synthesis phase) 发酵后期（ fermentation anahase）
8、 菌体自溶期（cell autolysis phase),五、微生物发酵基本过程特征,34,从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。 代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗 生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。 溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。 pH变化：先升后降以氨基酸为碳源，释放氨，后氨被利用。先降后升以糖为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，后被利用。,发酵前期特征,35,以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段时间。 菌体生长恒定就进入产物合成阶段。 呼吸强度：无明显变化，菌体数目不增加。 产物量：逐渐增加，生产速率加快，至最高峰后合成能力衰退。
9、 对外界变化敏感:容易影响代谢过程，从而影响整个发酵过程。,发酵中期特征,36,菌体衰老，细胞开始自溶的一段时间 合成产物能力衰退，生产速率减慢 氨基氮含量增加，pH上升 发酵必须结束，否则产物被破坏，菌体自溶给过滤和提取带来困难,发酵后期特征,37,第二节 制药微生物与产物的生物合成,制药微生物的选择 制药微生物的选育 微生物菌种的保藏 微生物代谢产物的生物合成 微生物生物合成的调节,38,（1）所需培养基易得，价格低廉； （2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等） （3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短 （4）单产高 （5）抗病毒能力强 （6）菌种纯粹，不易变异退化
10、，稳定性好 （7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全,一、制药微生物的选择,39,来源：大陆土壤、海洋水体 样品的采集：表层土壤(0-10cm)，海洋（0-100m） 预处理：根据分离目的和微生物的特性 1）温度 2）化学：SDS酵母膏，CaCO3，NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。 3）离心、膜分离。,生产菌的自然分离,40,培养基：选择适宜的培养基，营养和pH，添加抑制剂如抗生素，制霉菌素等。 分离方法： 1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲溶液 2）滤膜法：0.220.45um。细菌在膜上，放线菌
11、菌丝可穿透，进入培养基。 培养条件：放线菌25-30，32-37，45-50，7-14天至1月。,41,二、制药微生物菌种的选育,1、选育的目的 改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等 2、选育的方法： A、自然选育； B、诱变育种 C、杂交育种,42,定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。,自然选育,43,菌种分离纯化,1。稀释涂布,2。平板划线纯化,44,斜面传代,45,防止菌株衰退的措施,菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低. 1、衰退的可能原因 （1）、基因突变 （2）、分离现象 2、防止菌种
12、衰退的方法A、从菌种选育方面考虑；B、尽量减少传代次数 C、创造良好的培养条件；D、利用不易衰退的细胞传代; E、采用有效的菌种保藏方法,诱变育种,定义：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。 物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。 化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。 生物类：噬菌体，转座子。 特点：快速，简单，效益大。 缺点：无定向性。,诱变育种流程,出发菌种 单孢子悬液 诱变处理 高产菌株 单菌落初筛 稀释涂板 复筛 稳定性特性 中试放大 投入生产,杂交育种,概念： 两个不同基因型的菌株，通过结合或原生质体融合，使遗传物质发生重新组合，从中分离筛选出具
13、有优良性状的新菌株。 特点：有一定的定向性。 种类： 准性生殖 接合 原生质体融合,（1）准性生殖育种,概念：准性生殖 范围：放线菌，半知菌纲的真菌 过程： 两条菌丝 相互结合 异核体 二倍体 重组单倍体 产黄青霉：提高青霉素产量 对氟苯丙氨酸 灰黄链霉菌：灰黄霉素产量,准性生殖是指异核体（单个生物个体中含有两种或两种以上基因型）细胞中两个遗传物质不同地细胞核可以结合成杂合二倍体地细胞核。这种杂合二倍体的细胞核在有丝分裂过程中可以发生染色体和单倍体化,最后形成遗传物质重组的单倍体的过程。也就是不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。,（2）接合育种,范围：细菌、放线菌 过程： 两种细胞混合培
14、养 基因片段进入另一细胞 合子 重组单倍体 虽然有成功报导，但多数效果不显著,（3）原生质体融合育种,概念 通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，从而产生具有两个亲本遗传性状的新细胞. 用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，在高渗条件下，用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，再生细胞壁，从而获得异核体或重组子，这一技术叫原生质体融合。,55,原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。 目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化。 原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于
15、不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。 关键：保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。,三、微生物菌种的保藏,56,菌种保藏的方法,斜面保藏法、矿物油保藏法、 砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、 冷冻法、液态真空干燥法、 琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、 麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。,57,（1）斜面保藏法： 在4左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植培养后再继续保藏，如此反复。 优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。 缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存
16、时间不长（16个月），传代多，菌种容易变异。 适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌,58,（2）矿物油保藏法 将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。 适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种 （3）砂土管保藏法 利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。 适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。,59,（4）真空冷冻干燥法 先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。 特点： 它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。但是手续麻烦，需要一定的设备。 适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保藏效果不佳。,60,（5）其他保藏方法 冷冻法：分低温冷冻（20 ）与超低温冷冻（196 ）两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏 液态真空干燥法：菌体在
