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1、毕业论文文献综述食品质量与安全产纤维素酶的海洋细菌的筛选及初步鉴定摘要：由于地球上纤维素资源极其丰富，能将这一部分资源利用起来显的非常有意义，因此，纤维素酶的研究成了近几年科学研究的热点。海洋细菌酶因为有其特有的一些优势，更是研究者所中意的研究内容。分离纯化产酶菌株的方法很多，其中包括初筛的刚果红染色法，复筛的DNS法和鉴定菌株的16SrDNA法等。关键字：纤维素酶 海洋细菌 筛选 鉴定1.纤维素酶的概况1.1概念及分布纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称,是一个有多种水解酶组成的复合酶系。纤维素酶在自然界分布极为广泛，昆虫、软体动物、高等植物、细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶，
2、反刍动物的瘤胃及猪大肠中也有分解纤维素的细菌存在1。1.2分类从酶的作用特性出发可分成2大类:碱性纤维素酶和酸性纤维素酶。根据其作用方式一般又可将纤维素酶分为3类:外切-1, 4-葡聚糖苷酶(简称CBH)、内切-1,4-葡聚糖苷酶(简称EG)和-1, 4-葡萄糖苷酶(简称BG)2。在这3种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖。1.3作用机理 纤维素酶在促进纤维素、半纤维素分解的同时,还可促进植物细胞壁的溶解,使更多的植物细胞内容物溶解出来,有利于动物胃肠道的消化吸收。同时,纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌,补充内源酶的不足,并对内源酶进行调整,保证动物正常的消化吸收功能,起到防病、促生长的作
3、用,消除抗营养因子,促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液,增加消化物的黏度,对内源酶造成障碍,而添加纤维素酶可降低黏度,增加内源酶的扩散,提高酶与养分接触面积,促进饲料的良好消化。而纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物,在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物,从而使消化道内的消化作用得以顺利进行。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素,促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外,还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化。2纤维素酶的应用自从1906年Seilliere从蜗牛消化液中发现纤维素酶以来,人们对纤维
4、素酶做了大量的研究,特别是20世纪80年代以来,由于分子生物学的发展及生物工程技术的兴起,纤维素酶的研究出现了新的前景。现在纤维素酶的应用已扩展到医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域,其应用前景十分广阔3。专家预测,针对扮演绿色化学品的纤维素酶的研究开发利用是新世纪的可再生性资源的关键。对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意义。2.1在饲料工业上的应用2.1.1制备低纤维饲料 由真菌木霉和黑曲霉所产生的纤维素酶同时含有能将天然纤维素降解成易消化糖的多种酶组分,且降解纤维素的能力很强。利用纤维素酶这种特性,可使粗饲料制
5、作成低纤维饲料。这已在兔等家禽饲养中得到了试验应用,但推广面还很小2.1.2饲料酶制剂的制作和应用 酶制剂作为家畜饲料添加剂在国外已引起越来越多的关注。用于制作酶剂的酶有多种,由于家禽家畜一般难消化利用纤维素和半纤维素,因此,纤维素酶在饲料酶制剂中应用最为普遍。使用饲料纤维素酶制剂,可以促进动物的消化吸收,大大提高动物对饲料的利用率。2.1.3植物纤维原料酶水解生产饲料酵母 饲料酶母是重要的饲料蛋白资源,饲料酵母通过植物纤维原料水解后生产饲料酵母前景广阔。传统的植物纤维原料水解方法为酸法水解鉴于酸水解需高温、高压,对设备要求高,投资大,水解副产物多,糖得率低,水解液中有害物质多,不便于酵母繁殖
6、等缺点,纤维素酶法水解替代酸水解用于植物原料生产饲料酵母是必然趋势。2.2纤维素酶在造纸业中的应用【4】2.2.1用于废纸脱墨 用纤维素酶和半纤维素酶结合处理，可促进脱墨过程，并且能在低pH值的纸浆进行脱墨。四川轻化工学院的李文俊等【5】,对纤维素酶在废报纸脱墨中的应用进行了实验性探索。实验结果表明A酶法脱墨能获得比化学法脱墨更好的脱墨效果，还能改善浆料的强度及其滤水性。同时，还确定国产废报纸纤维素酶法脱墨最佳工艺条件为：pH6.0,酶用量0.1%，时间40min，温度40，浆浓5.5%。2.2.2用于处理造纸废料 一些难处理的废料如含纤维较低的脱墨淤泥（其中含40%-50%的无机墨水）和细小
7、纤维等，用酶法处理可节约开支，减少污染。纤维素酶首先将废料降解成糖，再将其转换成乙醇等化学原料或燃料，达夫谢列卢以每克底物10-40单位酶活性的比例使50%的脱墨淤泥转化成糖，而墨汁存在不影响酶活性；孙伟强等将造纸中的细小纤维进行细菌发酵可产酒精：陈惠忠等将酶解和发酵同时进行；可转化造纸厂的废纤维为酒精。2.2.3用于改善纸张性能 Mansfield等【6】,用复合纤维素酶Novozyme SP342选择性地单独处理纸浆的粗长纤维级分,可提高成浆得率,降低酶的使用量,并改善纸张的平滑度,从而改善纸张的印刷适性。尽管存在纸浆黏度和撕裂度降低的缺点,但纸浆的抗张强度增加10%,使粗糙的花旗松纤维原
8、料可以生产出高级纸品。3.海洋细菌纤维素酶的优势纤维素类物质是自然界中存在的最丰富的一类可再生的有机物质资源7。地球上每年光合作用产生大于100亿t的植物干物质,其中一半以上是纤维素和半纤维素8。如果利用纤维素酶将天然纤维素降解为可利用的糖液,再进一步转化为酒精、菌体蛋白、气体燃料(如氢气)等物质,对解决当今世界所面临的粮食短缺、饲料资源紧张、能源危机和环境污染等问题具有深远的意义9。然而，一直以来，研究者把分离纤维素降解菌的场所主要局限于陆地土壤中，使得纤维素酶的来源受到了很大的限制10。虽然目前仅有少数学者对产纤维素酶的海洋微生物进行了研究，但已显示出海洋微生物在开发纤维素酶方面具有诱人的
9、前景11。3.1细菌纤维素酶的优势微生物是纤维素酶的主要来源,其中主要有细菌、放线菌和真菌,目前研究的最清楚的是霉菌中的里氏木霉T.reesei，研究最多的是真菌12。细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤维素酶,这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱,长期以来没有得到足够的重视。但原核生物的基因一般不含内含子,可直接从基因组DNA中克隆到目的基因用于工程菌的构建。因此细菌纤维素酶基因的克隆,既利于研究纤维素酶基因的多样性,也利于高效纤维素酶基因工程菌的构建。随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用,以及耐热性纤维素酶在燃料酒精生产中应用,细菌纤维素酶制剂已显示出良好的
10、应用性能和巨大的经济价值13。3.2海洋细菌纤维素酶的特性 新近研究表明海洋微生物酶一般在高盐条件下仍具有高的活性，这使它们可以被应用到工业中某些需要苛刻条件的生产工艺中14；同时海洋微生物酶还具有耐高温、可以在室温下长时间保持高活性、耐极端pH等特性15。这些特性将可以在很大程度上解决因工业化生产中的高盐、高温、强碱或强酸等使酶失活的问题。因此，海洋细菌纤维素酶比陆地细菌更有优势，研究这方面内容也显得很有意义。 4产纤维素海洋细菌的筛选方法4.1 初筛411刚果红染色法16：2216E培养基配方【17】：蛋白胨5.0g，酵母汁膏1.0g,1000ml人工海水,2.0琼脂粉,pH7.67.8。
11、在2216E培养基中添加0.5%羧甲基纤维素钠，纤维素酶能催化分解羧甲基纤维素钠。室温培养72h后往培养基中加入0.1%的刚果红溶液，染色1h；弃去废液，加入1mol/LnaCl洗脱，浸泡1h。由于刚果红能与羧甲基纤维素钠发生结合，无法洗脱，所以若菌落周围出现透明圈，则说明该菌株能产纤维素酶。4.1.2台盼兰法(tiypan blue)18：将0.0075%的台盼兰染料作为一种成分直接加人到分离培养基中，培养一定时间后，在菌落周围产生较明显降解圈者即产纤维素酶。4.1.3 Unitex染色法(Unitex dyes):将培养适当时间的平板，用Unitex染料浸染平板，而后放到紫外灯下观察，菌落
12、周围有晕圈(halo)者，即产纤维素酶。4.2 复筛3,5-二硝基水杨酸法（DNS）【19】.：将初筛得到的菌株接种到羟甲基纤维素钠发酵培养基中培养后得到胞外和胞内的粗酶液，采用DNS法用紫外可见分光光度计与540nm处测定OD值，规定每分钟产生一个微克葡萄糖的酶量为一个酶单位（U）【20】。U越小则说明酶活性越强，所对应的菌株也就越优良。5 鉴定方法5.1细菌形态和生化学学特性试验：菌株纯化后，作培养特征，革兰氏染色，芽孢形成、细胞形态，运动性，菌落颜色，氧化酶和过氧化氢酶产生等细菌学特性试验，根据结果选择法国梅里埃公司API21鉴定条，测定菌株生理生化反应，按“革兰氏阴性杆菌新编码鉴定”系
13、统22、API细菌鉴定系统结合伯杰氏细菌鉴定手册19对菌株进行检索。5.2 16S rDNA法：采用引物27F 5-AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3，907F5-AAACTCAAATgAATTgACggg-3，517F 5-CCAgCAgC-CgCCggTAAT-3，进行菌株16S rDNA基因的扩增，50L的扩增体系含有：2单位Taq DNA聚合酶（Promega，Madison，Wis.，USA），1Taq buffer，2mmol/LMgCl2，0.2 mmol/L dNTP，引物各10 pmol。PCR扩增30个循环，每个循环包括94预变性2 min、58退火1 min和7
14、2延伸1.5 min，最后在72延伸10 min。扩增产物经纯化后送上海生工生物工程有限公司测序。将菌株序列经CLUSTALW1.8.123行多序列联配，使用Jukes and Cantor法24算进化距离用邻位相连法分析后通过MEGA3.1构建系统发育树，通过Bootstap法对树进行评估分析25。6发展前景随着人们对纤维素酶研究工作的深入,纤维素酶必将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。如何加大对纤维素酶研究和开发的科技投入和经费投入,改变目前规模小、工艺设备落后、菌种酶活低、生产成本高、生产技术水平低下的现状,尽快采用各种行之有效的高新技术,发展具有中国
15、自己知识产权的新酶种、新产品、新剂型,满足市场的需求是当务之急。同时,动物纤维素酶与微生物酶系有所不同,作为一个新的纤维素酶体系,它的研究也具有重大的理论价值,因此,可能成为纤维素酶研究的热点。尤其海洋细菌所产的纤维素酶具有许多独特的优势，在工业上将会更有应用前景。参考文献1 高伦江，董全，唐春红. 纤维素酶的研究进展及前景展望. 江苏食品与发酵,2007,35(4):14-172 窦烨，王清路，李俏俏.纤维素酶的应用现状J.中国酿造,2008,27(12):15-173 王菁莎,王颉,刘景彬.纤维素酶的应用现状J。中国食品添加剂,2005,（5）:107-119.4 郝月,杨翔华,洪新.纤维素酶的应用研究J.青海科技,2005,(3):31-35.5 李文俊,杨玲.纤维素酶用于废纸脱墨J.西南造纸,2006,（6）:11-13.6 秦全贵,等.纤维素酶与造纸工业J.广西轻工业,1197,(3):12-15.7 张加春,易琴,黄遵锡.纤维素酶曲的潜盘生产研究J.云南师范大学学报(自然科学版), 2002, (2):50-52.8 Leschine S B. Cellulose degradation in anaerobic environmentsJ. Annu RevMicrobio,199
