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1、 细胞细胞电转染电转染 电转的简介 . 1 电穿孔转染的基本原理及过程 . 1 电穿孔转染条件的选择 . 1 1 电参数 . 1 2 脉冲时程 . 2 3 脉冲次数 . 2 4 细胞因素 . 3 5 质粒因素 . 3 6 温度 . 4 7缓冲液以及培养液的成 . 4 仪器常用键区介绍 . 5 Neon TM电转染一般流程 . 7 电转的简介电转的简介 电穿孔转染，作为物理方法的一种，出现于 20 世纪 80 年代中。这种方法不仅能 够将 DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物 细胞和植物细胞。它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可 比拟的优越性，如
2、操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，适用谱广等。尤其 对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。 电穿孔转染的基本原理及过程电穿孔转染的基本原理及过程 电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后， 在细胞膜上暂时形成小孔 或开口， 把大分子如 DNA 等导入细胞并最终进入胞核的技术。 其过程简述如下： 首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触， 并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。再次电击后，质粒脱离复 合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始 稳转。一旦 DNA 扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可 自动重新闭
3、合。 电穿孔转染条件的选择电穿孔转染条件的选择 1 电参电参数数 电场强度 E 与电压 V 有以下关系：V=E d，在电穿孔实验中，d 为两电极之间的 距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。对于动物细胞 来说，电场强度通常选择 11000Vcm，并遵循低电场长时程的原则。电场强 度的大小对 DNA 摄入量的影响主要有：在阈电场强度 Ec (Ec=Uc15R)以下 无 R)以下无 DNA 摄入；适中的场强下 DNA 的摄入呈电场依赖型，随场强的升 高而增大；高场强下，DNA 的摄入进入平台期，与电场的大小无关。电场强度 的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无
4、变化；在适中的 场强下， 存活率呈电场依赖型， 随场强的升高而下降； 存活率在高场强下降为 0。 因此， 要保证较高的转染效率， 必须综合考虑 DNA 摄入量以及存活率两个方面。 不同的细胞系具有不同的最佳场强值， 其确定方式除了实验直接测定比较不同场 强下(对悬浮细胞来说，取 13 倍的阈电场强度，对贴壁细胞来说可升至 5 倍) 转染率的高低之外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在 50左 右的电场参数为较理想的参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。 2 脉冲时程脉冲时程 时间常数为电容与电阻的乘积，是设定的电压呈指数衰减到 37的时间。电脉 冲的时间长短对 电转染效率有较大的
5、影响，太长、太短都会使转染效 率下降。 最佳时间的确定主要取决于细胞的大小， 细胞越大，穿透胞膜所需的脉冲时程 越长。 电转染 真核细胞的脉冲时程一般控制在 ms 级(不小于 1 ms)。 电脉冲之前， DNA 和细胞随机分布于电极之 间；电脉冲早期，DNA 和细胞向阳极运动；电 脉冲后期 DNA 分子撞向细胞阴极面或末端，并且插入细 胞外膜或者进一步进 入细胞膜间隙，随后在孵育期间，DNA 通过内膜渗透进入胞质。因此电压脉冲 有双重效应，即驱使 DNA 快速向阳极运动以及向受 体细胞表面渗透。电脉冲 的时间太短，则不能使 DNA 分子有效进入细胞；而电脉冲时间过长，细 胞局 部过热可导致不可
6、恢复的损伤，同时电泳所引 起的细胞内外的物质进出(如 Na+ K+浓度差的破 坏)都可引起细胞存活率下降，转染效率的提高被抵 消。真核 细胞基因转染一般遵循低电场长时程的原 则。 长时程(一般 2060 ms)可使细胞 上的穿孔更 大，开放时间更长。此外，适当地延长时程也能降低 电穿孔的阈电 场值，加大电场依赖性吸收的斜率，提 高平台期电场值的放大作用。 3 脉冲次数脉冲次数 脉冲次数的选择一般为 110 次，实验证明对 于大多数细胞系较理想的脉冲次 数为 34 次。 第 1 次脉冲后， 外加的电场开始在细胞膜上穿孔， 第 2 次脉冲后， DNA 在电泳力以及细胞膜蛋白运输的共同作用下转入细胞
7、，当然脉冲也同样触 发电渗透、扩散、内吞等运输方式。理论上，2 次脉冲足以使 DNA 转入绝大多 数细胞，再增加脉冲次数，虽仍有 助于提高转染效率，但如果次数多于 5 次， 导致细胞 损伤直至死亡的负面效应便抵消了对转染效率的提 升。 两次脉冲之间 一般有 1 min 的间隔时间(稍长 也不影响结果)，在这段时间内，电穿孔的细胞可 再 生一些必需的细胞膜成分，以恢复部分功能，同时，细胞在这段恢复时期发 生旋转(Brownian 运动)，基本解除胞膜的同一位置被多次电击的危险。 4 细胞因素细胞因素 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细 胞(15 代以内，传代后 2 d)。因为 处于对数生长
8、期 的细胞分裂旺盛， 表面结构致密度比稳定期的细胞 差， 电转后， 细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源的 DNA。因 此，处于对 数期的细胞转染率和存活率都比衰老的细胞好。当细胞生长到 A600 为 0.720.78 时，可获得更高的转 染效率，故收集细胞的时间十分重要。细胞 悬液的 密度一般为 1106ml， 当细胞生长密度3106ml(A600O 85)时， 转染效率会骤然下降。原因除 了细胞老化之外，细胞过密会使相邻细胞相互作 用增大，甚至使细胞相互融合，从而导致电场的局部微扰，使电场环境无法均一 化。细胞体积越大对电击 越敏感，所需的电场强度也就越小。 5 质粒
9、因素质粒因素 从质粒的浓度看， 细胞密度为 1106ml 时， DNA 用量在 25ugml 转染效 率最高。转染率在一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高，但到达 一个峰值 后，随 DNA 用量增加而转染率逐渐下降。 其原因可能为细胞吸纳 DNA 有一个 饱和度，过量 便会产生毒性，使存活率降低，不利于转染率的提 高。从质粒的 大小、 构象、 序列看， 一般说来， 转染 效率随着质粒的碱基对数的增多而上升， 同时，线状 的 DNA 比环状 DNA 的转染效率更高，而且更容易进入核内整合到 染色体上，得到稳定表达。所以在 电转前一般选择合适的限制性内切酶，将质 粒线性 化，以期得到较高的转染效率
10、。此外，如 CMV、SV40 等病毒启动子有 助于基因在真核细胞内的高效表达。从质粒的纯度看，用高纯度的 DNA 才 能 提高电转的效率，且应注意以下几点：首先 DNARNA 应该超纯(A260 A2801 8)， 其次应不含内毒 素， 同时质粒应溶于双蒸水而不是 TE 缓冲溶液， 因 为当 DNA 样品中存在 EDTA 或缓冲盐类(如 Tri 时，转染效率会急剧下降。 6 温度温度 一般情况下，电转的过程是在室温下进行，但在 电击前后可对细胞进行冰浴处 理。电击前冰浴的时间对转染率影响不大，但低温环境能够防止 DNA 被外源性 DNA 酶降解，并限制在电击中因 Joule 作用而产生的不良反
11、应，因此，实验一般 选择电击前冰浴 5min。电击后冰浴，会影响 DNA 摄入，因为电击后冰浴可增强 细胞收缩，细胞膜上的 电穿孔封闭较慢，延长外源性 DNA 摄入时间，从而提 高其摄入量。在室温环境下，虽然细胞膜上的孔 封闭速度快，但在随后 2h，质 粒还可通过电内化进入细胞，因此摄人量不一定比 4环境下低。而且，室温下 细胞在 5 min 内即闭孔，在 4的环境下穿孔状态可保持 4h，穿孔封闭缓慢降低 了存活率， 同时细胞在低温下更容易受到损伤， 因此， 综合考虑摄人量和存活率， 大部分文献倾向于电击后细胞仍在室温或 37下保存。 7缓冲液以及培养液的成缓冲液以及培养液的成 电转前培养液的
12、选择：真核细胞常用 RPMI 1640+10FCS(胎牛血清)培养。 电转培养液 选择：细胞受电击后产生孔洞使细胞质与电转缓冲 液直接接触，因 此细胞对渗透压和缓冲液离子组成 十分敏感。从渗透压来说，低渗缓冲液比等 渗或高 渗缓冲液更利于获得较高转染率，因为低渗的环境 可降低电导并限制 Joule 作用，利于质粒的转染。 对于不同的细胞系也可将等渗和低渗的缓冲液按 不 同的比例混合使用。 最佳的混合物是使细胞在达到最大程度肿胀(达到最大细 胞直径)的同时，细胞裂解死亡率又小于 10。从组成来说，常用的电转缓 冲液 分 3 类：第 1 类为细胞培养液，如 RPMI 1640， DMEM，DMEM
13、F12 等；第 2 类为磷酸缓冲液，如 KPBS，HBS，HeBs，PBS 等；第 3 类为 Cytomix 缓 冲 液，Cytomix 配方如下：120 mmolL KCI，0.15 mmolL CaCl2，10 mmolL K2HP04(pH=7 6)， 25 mmolL HEPES(pH=7 6)， 2 mmolL EGTA (pH=7 6)， 5 mmolL MgCl2，2 mmolL ATP，5 mmolL 谷胱苷肽。相比之下，Cytomix 的转染 率最高， 特别是对难以转染的半贴壁细胞和悬浮细 胞， 而且死亡率较低。 Cytomix 缓冲液组成与细胞 内离子成份非常相似。有助于细胞保持其通透性。 与常用的电转缓冲液 PBS 和完全培养液相比，Cytomix 缓冲液中 Ca2+、M92+、 Na+浓度低，用 EGTA 代替 EDTA，pH 值、K+浓度
