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1、体外表达：无细胞表达系统 原核表达系统：大肠杆菌表达系统等 体内表达： 酵母表达系统 真核表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 动物/植物表达系统（转基因动物/植物）,体系选择,研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物,一、体外表达系统（无细胞表达系统）,体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表达系统而言的开放型表达系统。 优点：内源型mRNA干扰很小，操作程序简单，获得重组蛋
2、白周期很短。主要用于蛋白质快速分析鉴定；基因转录和翻译调控机理研究；分子间的相互作用的研究。 缺点： 昂贵； 操作要求高； 表达量不够高。,主要的体外表达系统： 1、兔网织红细胞系统，由新西兰大白兔制备。 2、麦胚提取物系统，可稳定地表达一些在兔网织红细胞中翻译受到抑制的DNA。 3、原核体外翻译系统（S30原核体外翻译系统）， E.coli S30提取物由OmpT内切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制备，所以在S30系统中表达基因可以增加产物的稳定性。,目前多家公司有商业化产品，常见的有： RTS E.Coli 系统; RTS100 wheat germ CECF系统 (Roche
3、) TNT快速偶联转录/翻译系统 (Promega)； Gold TNT T7 Express 96系统 （Promega），该系统有SP6和T7两种类型，适合在96孔板上进行大规模高通量筛选分析； TNT T7 Quick for PCR DNA (promega)，PCR DNA 的TNT T7快速系统从PCR反应液中直接取样，无需纯化DNA，直接用于偶联的转录/翻译反应； TNT 偶联小麦胚芽抽提系统 (promega)。,二、原核表达系统,特点：产量高、生长速度快、操作容易、成本低。 缺点： 翻译后加工修饰体系不完善：无糖基化、酰基化等 一般表达获得的蛋白常常以变性状态存在，不具有生物
4、学活性。,（一）大肠杆菌表达系统,目前较常用的表达载体是具有可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高，表达量可占细菌总蛋白的25以上。 T7RNA聚合酶来源于T7噬菌体，期活性高于大肠杆菌RNA聚合酶很多倍，而且较少发生转录中止 它只识别自己的启动序列，不能启动大肠杆菌DNA的转录，对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的条件下，使目的基因得到大量扩增 正常大肠杆菌并不表达T7RNA聚合酶，为了能利用T7启动子表达外源基因，将T7RNA聚合酶基因置于lacUV5启动子控制下，整合到大肠杆菌染色体，构建了能被IPTG诱导表达T7RNA聚合酶
5、的大肠杆菌菌株 常用宿主细胞有BL21（DE3）、JM109（DE3）等 还有受温度变化诱导的具有噬菌体PL启动子调控 的载体等。,按蛋白质类型分 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽 按启动子分 lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导 lamda phage PL和PR 启动子 热诱导 T7 启动子 IPTG诱导 T5 启动子 IPTG诱导 ara启动子 阿拉伯糖诱导,大肠杆菌表达载体分类,常见的大肠杆菌商业化表达系
6、统有： 1、pET system and pETBlue system（Novagen公司），是原核蛋白表达中应用最多的系统。具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌。目前共有包括40多种载体、15种不同宿主菌和配套齐全的用于有效检测和纯化目标蛋白的相关产品。 基本结构由T7启动子、核糖体结合位点、信号肽序列、多克隆位点、T7转录终止信号、氨苄青霉素抗性基因核质粒复制位点等 有可以表达N端融合、C端融合和非融合蛋白的不同质粒。也可以表达非分泌性蛋白 2、pBAD表达系统（Invitrogen公司），可控制蛋白质的生产水平低于其成为不溶性蛋白的域值。通过与硫氧还蛋白的
7、融合来增加溶解度 3、QIAexpress Expression System（Qiagen公司 ）。,pJLA50X系列; pcDNAII; etc pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) pBAD系列 (Arabinose诱导型),常用表达载体,pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs),BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列
8、等带T7启动子的载体 M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体 BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变 Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变 适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键 BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达 BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达,特殊的表达用菌株,外源基因在原核细胞中的表达形式,按表
9、达蛋白的部位分： 分泌表达； 外周质及膜上表达 ； 胞内表达。,外源基因在原核细胞中的表达形式,在原核细胞中表达外源基因时，可产生融合型、非融合型。 原则上应能够使外源基因表达效率高，蛋白质产量高，不易被细菌分解，而且产物易被提取、纯化。,融合基因的表达,外源基因在大肠杆菌中表达的一种简便方法是使其表达为融合蛋白，也就是说要表达的外源基因连接在一段原核基因的下游，蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由外源DNA的完整序列编码，这样的蛋白质由1条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。,融合蛋白的特点,转录和翻译起始从正常的大肠杆菌序列开始，故
10、通常可以产生高水平的融合蛋白； 融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定； 产生的融合蛋白较大，容易从蛋白质凝胶电泳中区别出夹，而且融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻于燥，磨成粉末后即可作为抗原； 有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外。这有助于蛋白质的分离和纯化。,融合方式,6His Tag融合 半乳糖苷酶融合 trpE融合蛋白 谷胱甘肽S转移酶（GST）融合 硫氧还蛋白（Trx）融合 麦芽糖结合蛋白（MBP）融合 碱性磷酸酶（phoA）启动子和信号序列,Protein A GST（glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, B
11、ioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin *帮助二硫键形成 Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫键的形成与 SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀,各种融合蛋白表达载体,帮助
12、可溶化,帮助分泌到周质,可用亲和层析纯化,His-tag (6-8 Histidine) T7-tag (MASMTGGQQMG) HSV-tag (QPELAPEDPED) S-tag (KETAAKFERQHMDS) VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK) HA-tag (YPYDVPDYA) Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL),各种用于抗体识别的标记,如果所表达的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构, 尽可能进行可溶性表达; 如果所表达的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清, 采用包含体表达比较好; 如果希望表达的多肽的分子量小于10 k
13、Da, 一定要进行融合表达,采用MBD融合 采用GST融合 采用CBD融合 采用thioredoxin融合 采用Origami等宿主菌 降低菌体培养的速度 温度 (15-30), 降低转速,让表达产物可溶化,采用CBD融合 (pET36/37) 采用Dsb融合 (pET39/40) 采用带pelB/ompT引导肽的载体 (pET12/20/22) 采用带MBD融合 (pMAL载体, Biolabs) 采用带SUMO融合 (pET SUMO, Invitrogen),让蛋白质分泌到间质去,融合表达的蛋白，在分离纯化过程中往往需要去除表达时额外引入的融合片段。因此需要用不同方法将其裂解，通常有：
14、1、化学裂解法：特异识别特定的氨基酸残基或一组氨基酸残基。但化学裂解法裂解位点的特异性低，有时可能对目标蛋白产生不必要修饰 如：甲酸、溴化氰等 2、酶解法：反应条件温和，具有高度的特异性。常用的酶有Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等。但酶解法成本高 ，反应时间长，更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目标蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。,DTT: intein的Cys 溴化氰: Met Thrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGR Enterokinase: DDDDK PreScissionTM protease: LEVLFQGP Genenase I TM
15、 PGAAHY TEV protease: ENLYFQ G,融合蛋白的专一性切割,3、IMPACT系统(intein mediated purification with an affinity chitin-binding Tag) 该系统是由枯草杆菌来源的几丁质结合域（5kD，chitin binding domain，用于亲和纯化）和酵母蛋白质剪接元件 intein组成一个双效的融合标签。 intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，释放出与之相连的目的蛋白。因此融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目的蛋白与fusion tag的精确切割。但含有较多二硫键的蛋白不适合这一系统
16、。,分泌型表达,为减少所需蛋白质在宿主体内被蛋白酶降解。或者使蛋白质能够在体外正确折叠和便于提纯，经常需要将被表达的蛋白质分泌到细胞外，因此要用分泌型载体。,分泌型载体的优点,一些在胞内被蛋白酶降解的蛋白质在细胞周质中很稳定； 一些在胞内无活性的蛋白质在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白质能够正确折叠； 产生的蛋白质没有氨基末端甲硫氨酸，因为切割位点在信号肽与编码序列之间，甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性。,蛋白质能够在大肠杆菌中进行分泌，至少要具备3个要素： 有一段信号肽； 在成熟蛋白质内有适当的与分泌相关的氨基酸序列； 细胞内有相应的转运机制。,信号肽长度一般为1530个氨基酸残基 真核生物和原核生物的信号肽在结构上都有以下特征： 信号肽一般都
