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1、1,第六章 微生物的生长及其控制,2,群体的生长可用其重量、体积、个体浓度或密度等作指标来测定。所以个体和群体间有以下关系： 个体生长 个体繁殖 群体生长 群体生长=个体生长个体繁殖,3,第一节测定生长繁殖的方法,一测生长量 适用于一切微生物 （一）直接法 有粗放的测体积法（在刻度离心管中测沉降量）和精确的称干重法。微生物的干重一般为其湿重的10%20%。,4,（二）间接法,1，比浊法 分光光度法对无色的微生物悬浮液测定，波长450650 nm波段。 若要连续跟踪某一培养物的生长动态，可用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。,5,2生理指标法 与微生物生长量相平行的生理指标，根据实验目的和条件适当选
2、用。 最重要的如测含量氮法,6,二、计繁殖数,测定繁殖一定要一一计算各个体的数目。 计繁殖数只适宜于测定处于单细胞状态的细菌和酵母菌， 而对放线菌和霉菌等丝状生长的微生物而言，则只能计算其孢子数。,7,（一）直接法,指用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。 此法得到的数目是包括死细胞在内的总菌数。 解决方法，已有用特殊染料作活菌染色后再用光学显微镜计数的方法，(酵母菌美蓝液染色、细菌丫啶橙染色 ）。,8,血球计数板在光学显微镜下直接进行计数的方法。,9,（二）间接法,是一种活菌计数法。这是一种依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落的原理而设计的。 最常用的
3、方法是利用固体培养基上（内）形成菌落的菌落计数法。,10,1平板菌落计数法 可用浇注平板或涂布平板等方法进行。此法适用于各种好氧菌或厌氧菌。,操作：把稀释后的菌样分散在琼脂平板上（内），培养后，形成一个个单菌落，此即“菌落形成单位”（cfu），根据每皿上形成的cfu数乘上稀释度就可推算出菌样的含菌数。,11,12,2.厌氧菌的菌落计数法 采用亨盖特滚管培养法进行。,13,第二节 微生物的生长规律,一、微生物的个体生长和同步生长 1、用电子显微镜观察细胞的超薄切片 2、使用同步培养技术 同步培养技术: 即设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后通过分析此群体在各阶
4、段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。 同步生长: 这种通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态.,14,获得微生物同步生长的方法主要有两类,获得微生物同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法 用氯霉素抑制细菌蛋白质合成； 细菌芽孢诱导发芽； 藻类细胞的光照、黑暗控制 用EDTA或离子载体处理酵母菌； 以及短期热休克（40 T）法用于原生动物（梨形四膜虫）等。,15,机械筛选法 利用处于同一生长阶段细胞的体积、大小的相同性，用过滤法、密度梯度梯度离心法或膜洗脱法收集同步生长的细胞。其中以的膜洗脱法较有效和常用,16,二、单细胞微生物的典型生长曲线,定
5、量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线。 以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可画出一条由延滞期、指数期、稳定期和衰亡期4个阶段组成的曲线，,17,延滞期的特点为： 生长速率常数为零； 细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状. ； 细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性； 合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产生各种诱导酶； 对外界不良条件如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感。,18,影响延滞期长短的因素很多 除菌种外，主要有3种： (1)接种龄指接种物或种子的生长年龄 (2）接种接种量的大小明显影响延滞期的长短
6、。 (3）培养基成分,19,（二）指数期,指数期：又称对数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。 指数期的特点是： 生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间代时 细胞进行平衡生长， 酶系活跃，代谢旺盛。,20,影响指数期微生物代时长短的因素,菌种 营养成分 营养物浓度 培养温度,21,（三）稳定期,稳定期又称恒定期或最高生长期。 特点:生长速率常数R等于零，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。,22,（四）衰亡期,在衰亡期中，微生物的个体死亡速度超过新生速度，整个群体呈现负生长状态（R为负值）。 特点:细胞形态发生多形
7、化， 例如会发生退化形态； 发生自溶 合成或释放次生代谢物； 芽孢杆菌中释放芽孢.,23,三、微生物的连续培养,连续培养的实现:当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时， 一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通人无菌空气，并立即搅拌均匀； 另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。 容器内的培养物达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡定的生长速率上，形成了连续生长。,24,两种连续培养器,恒浊器： 根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。,(1）按控制方式分,25,恒化器：与
8、恒浊器相反，恒化器是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置。,26,（2）按培养器级分,单级连续培养器 代谢产物的产生速率与菌体生长速率相平行 . 多级连续培养器 生产的产物恰与菌体生长不平行，应根据两者的产生规律，设计与其相适应的多级连续培养装置。,27,四、微生物的高密度培养,微生物的高密度培养: 也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。,28,进行高密度培养的具体方法,选取最佳培养基成分和各成分含量 补料 提高溶解氧的浓度 防止有害代谢产物的生成,29,第三节 影响微
9、生物生长的主要因素,一、温度 最适生长温度经常简称为“最适温度”，其涵义为某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。,30,二、氧气,(1)专性好氧菌 (2)兼性厌氧菌 (3)微好氧菌 (4耐氧菌 (5)厌氧菌,31,32,三、pH,pH值: 表示某水溶液中氢离子浓度的负对数值，它源于法文“puissance hudrogene”（氢的强度）。 纯水呈中性，氢离子浓度为10-7 mol/L,因此定其pH值为7.0, 7，呈酸性， pH7者呈碱性。,33,虽然微生物外环境的pH变化很大，但细胞内环境中的pH却相当稳定，一般都接近中性。,34,调整pH,35,第四节微生物培养法概论,一个良好的微
10、生物培养装置的基本条件是： 按微生物的生长规律进行 科学的设计 丰富而均匀营养物质 适宜的温度和良好的通气条件 适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。,36,微生物培养技术发展的轨迹有以下特点： 从少量培养到大规模培养； 从浅层培养发展到厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养； 从以固体培养技术为主到以液体培养技术为主； 从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养； 从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养； 从利用聚散的微生物细胞发展到利用固定化细胞； 从单纯利用微生物细胞到利用动物、植物细胞进行大规模培养； 从利用野生型菌种发展到利用变异株直至遗传工程菌株；从单菌发酵发展到混菌发酵； 从低
11、密度培养发展到高密度培养； 从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐；,37,一、实验室培养法,(一)固体培养法 1好氧菌的固体培养 试管斜面 培养皿琼脂平板 克氏扁瓶 茄子瓶等 进行培养。,38,2.厌氧菌的固体培养,(1)高层琼脂柱 含有还原剂，表层溶氧，深层氧化还原势低，有利于生长。 (2)厌氧培养皿 特制皿盖创造狭窄空间，再加上还原性培养基. (3)亨盖特滚管技术 划时代意义的创造.,39,(4）厌氧罐技术,采用抽气换气法驱走空气。,40,5)厌氧手套箱技术,厌氧手套箱技术 箱体气体成分为N2: CO2:H2=85:5:10( V/ V) ，并有钯催化剂保证高度无氧状
12、态。,41,（二）液体培养法,1好氧菌的液体培养 (1)试管液体培养 (2)三角瓶浅层液体培养 (3)摇瓶培养(振荡培养) (4)台式发酵罐,2厌氧菌的液体培养,42,二、生产实践中培养微生物的装置,（一）固态培养法 1好氧菌的曲法培养 曲的定义 解释：,43,2厌氧菌的堆积培养法 生产名优大曲酒（蒸馏白酒）,44,(1）浅盘培养: 好氧菌浅层液体静止培养方法。 (2) 深层液体通气培养 发酵罐深层液体通气搅拌的培养技术,(二)液体培养法,45,发酵罐,培养基配制系统 蒸气灭菌系统 空气压缩和过滤系统 营养物流加系统 传感器和自动记录、调控系统 发酵产物的后处理系统,46,第五节有害微生物的控
13、制,一、几个基本概念 控制有害微生物的措施,47,（一）灭菌,灭菌:采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌，例如高温灭菌、辐射灭菌等。.,灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种,48,消毒:是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。,49,（三）防腐,防腐:是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过制菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。 防腐的方法 低温 缺氧 干燥 高渗 高酸度 高醇度 加防腐剂,50,（四）化疗,化疗:即化学治疗，是指利用具有高度选择毒力即对病
14、原菌具高度毒力而对其宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。 使用药剂: 磺胺类等化学合成药物、抗生素、生物药物素和若干中草药中有效成分等.,51,四个概念的比较:,52,二、物理灭菌因素的代表高温,（一）高温灭菌的种类 原理：高温的致死作用，主要是它可引起蛋白质、核酸和脂类等重要生物高分子发生降解或改变其空间结构等，从而变性或破坏。,53,1干热灭菌法,干热灭菌法： 把金属器械或洗净的玻璃器皿放入电热烘箱内，在150170下维持12h后，可达到彻底灭菌（包括细菌的芽孢）的目的。,54,2湿热灭菌法,湿热灭菌法是指用100以上的加压蒸气进行
15、灭菌。,（1)常压法,巴氏消毒法 煮沸消毒法 间歇灭菌法,55,（2）加压法,常规加压蒸气灭菌法 连续加压蒸气灭菌法 培养基一般加热至135140下维持5、15 s。,（3）温度杀菌的两个指标,热死时间：指在某一温度下，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。,热死温度：又称热死点，指在一定时间内（一般为10 min)，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。,56,（二）影响加压蒸气灭菌效果的因素,1灭菌物体含菌量 2.灭菌锅内空气排除程度 3灭菌对象的pH 4灭菌对象的体积 5加热与散热速度,57,（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止,1有害影响,梅拉特反应：主要是由氨基化合物（氨
16、基酸、肽、蛋白质）与羰基化合物（糖类）间发生复杂的反应，产生褐变的机制,58,2防止法,（1) 采用特殊加热灭菌法 (2）过滤除菌法 (3) 其他方法,59,三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,药效和毒性评价指标： 最低抑制浓度（MIC）：是评定某化学药物药效强弱的指标，指在一定条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度； 半致死剂（ LD50。）：是评定某药物毒性强弱的指标，指在一定条件下，某化学药剂能杀死50%试验动物时的剂量； 最低致死剂（MLD）：是评定某药物毒性强弱的另一指标，指在一定条件下，某化学药物能引起试验动物群体100%死亡率的最低剂量。,60,（一）表面消毒剂,表面消毒剂：是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。 比较的标准 ：石炭酸系数 P.C .,61,62,（二）抗代谢药物的代表磺胺类药物,1、抗代谢药物: 又称代谢拮抗物或代谢类似物，是指一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰正常
