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1、基因工程,基因工程概念：,指按照人们的愿望，通过体外DNA重组和转基因等技术，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向改造生物的遗传性状，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品,操作水平：,DNA分子水平,别称：,DNA拼接技术或DNA重组技术,操作环境：,生物体外,优点：,原理：,基因重组,可以按照人们的意愿，打破物种界限，直接定向地改造生物的性状,一、DNA重组技术的基本工具 1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源： (2)功能： (3)作用部位： (4)识别序列的特点： (5)作用结果：,主要从原核生物中分离。,识别双链DN
2、A分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,具有专一性,磷酸二酯键,大多由6个核苷酸组成的序列。,产生黏性末端或平末端。,2.“分子缝合针”DNA连接酶,(1)功能： (2)作用位点： (2)分类：,E.coli DNA连接酶：,来源于大肠杆菌 只能连接黏性末端,T4DNA连接酶：,来源于T4噬菌体 能连接黏性末端和平末端，但连接平末端的效率较低,将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。,磷酸二酯键。,E.coli DNA连接酶 和T4DNA连接酶,3.“分子运输车”运载体,(1)载体具备的条件： 能在受体细胞中复制并稳定保存。 具有一个至多个限制酶
3、切点，以便外源DNA片段插入。 具有标记基因，供重组DNA的鉴定和筛选。 (2)载体种类： (3)作用原理：,携带外源基因的载体进入宿主细胞后，停留在细胞内进行自我复制，或整合到染色体上，随之同步复制,质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒， 最常用的载体是质粒。,质粒：,一种裸露的独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。,用作载体的质粒大多是在天然质粒的基础上经过人工加工改造的,二、基因工程基本操作步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,mRNA,
4、mRNA前体,mRNA,总结： 1.原核生物的基因编码区为连续的；真核生物的基因编码区为不连续的 2.mRNA无启动子和终止子以及内含子所对应的序列 3.真核生物的基因直接导入原核生物中无法表达，因为原核生物无内含子所对应的RNA序列的剪切系统,原核生物基因,真核生物基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、化学方法人工合成,1. 基因文库的概念:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库,2. 基因文库的种类:,基因组文库：含有一种生物的全部基因的文库,部分基因文
5、库：只包含了一种生物的部分基因 的文库如：cDNA文库,cDNA：,由mRNA逆转录而来的双链DNA 无启动子、终止子和内含子,提取某种生物的全部DNA,用适当的 限制酶,一定大小的DNA片段,将DNA片段 与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,基因组文库的构建,cDNA文库的构建反转录法,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体 连接,cDNA文库,逆转录酶,DNA 聚合酶,导入受体菌 中储存,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,注意：,基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。,一、目的基因的获取,1
6、、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,（一）操作前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物,（二）原理：,DNA的复制,两种引物（一小段单链DNA）,（三）条件,耐高温DNA聚合酶,原料(脱氧核苷酸),模板,（四）扩增形式：,指数形式（2n）,（目的基因）,9095,3,5,3,5,1.变性（90-95）：双链DNA热变性解螺旋为单链DNA,2.退火（55-60）：温度下降至55-60时，两种引物通过碱基互补配对与目的基因的两端结合，也称复性,3.延伸（70-75）： 当温度上升至70-75溶液中的脱氧核苷酸（A、T、G、C）在耐热性的DNA聚合酶（Taq酶）作用下，根据碱基互不
7、配对合成新的DNA互补单链，合成新的目的基因。,(三)、PCR技术扩增（多聚酶链式反应）过程,4.循环：新合成的目的基因再循环经过变性、复性、延伸三步,DNA复制,解旋方式,场所,酶,温度条件,合成的对象,区别,解旋酶催化,PCR技术,DNA在高温作用下变性解旋,细胞内 （主要在细胞核内）,PCR扩增仪,DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶,耐热的DNA聚合酶（Taq酶）,细胞内温和条件,需控制温度，在较高温度下进行,DNA分子,DNA片段或基因,联系,ATP,需要,不需要,1.模板：均需要模板；2.原料：脱氧核苷酸；3.引物：均需要引物，使DNA聚合酶沿5至3方向合成子链DNA,DNA复制与PC
8、R技术比较,逆转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆转录,一、目的基因的获取,人工合成法,推测,推测,单链DNA,合成,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成法,DNA合成仪,问题,3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_,获取目的基因的三种方法应用,1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用_,2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用_,PCR技术扩增,化学方法人工合成,构建基因文库的方法,4、已知目的基因所编码的氨基酸序列，可采用_,化学方法人工合成,步骤二
9、：构建基因表达载体基因工程的核心,1,目的（作用）： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2,基因表达载体的组成： 目的基因+启动子+终止子 +标记基因+复制原点等,表达载体的组成,启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止子：终止mRNA的转录 标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 复制原点：能起始复制并带着插入目的基因一起复制,步骤三、将目的基因导入受体细胞,1,转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞 内维持稳定和表达的过程称为转化。,2,目的基因导入受体细胞的原理：
10、借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,1、目的基因导入微生物细胞的方法,2、将目的基因导入植物细胞,3、将目的基因导入动物细胞,1、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 常用菌： 常用法： 过程：,Ca2+处理 细菌,感受态 细胞,感受态细胞 吸收DNA,表达载体 与感受态 细胞混合,大肠杆菌,Ca2+处理法，获得感受态细胞,2、目的基因导入植物细胞的方法,（1）农杆菌转化法,农杆菌特点：,原理：,原因：双子叶植物和裸子植物受损伤时伤口处会分泌酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,农杆菌的Ti
11、质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,Ca+处理 转入,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,农杆菌,植物体细胞,导入,整合到染色体上 稳定维持和表达,过程：,植物组织培养,具有新性状的植株,1、目的基因导入植物细胞的方法,（1）农杆菌转化法,（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞,利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中,（3）花粉管通道法：我国独创,基因表达载体借助花粉管通道进入受体细胞,3、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,1.提纯含目的基因的表达载体溶液，使DNA浓度保持在13ug
12、/mL。 2.从雌性动物体内取出卵（受精卵），采用显微注射仪进行注射 3.将注射了目的基因的受精卵经胚胎早期培养后移至雌性动物的输卵管或子宫，使其发育成具有新性状的动物,转基因植物的获得方法：,Ca+处理 转入,构建基因表达载体,农杆菌,植物体细胞,导入,植物组织培养,具有新性状的植株,显微注 射法,构建基因表达载体,动物受精卵细胞,早期胚胎,早期胚胎培养,胚胎移植,代孕动物,妊娠,转基因动物,转基因动物的获得方法：,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？,1,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,2,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表
13、达？,不一定，需要检测,1、鉴定分子水平的鉴定,转基因生 物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）目的基因是否导入成功,基因探针：,放射性同位素等标记的含有目的基因DNA片段,方法,DNA分子杂交技术：DNA-DNA杂交,变性,变性,1、鉴定分子水平的鉴定,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,转基因生物 的mRNA,14N,14N,DNA-mRNA杂交：用标记的目的基因做探针与mRNA杂交,15N,1、鉴定分子水平的鉴定,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,目的基因相应蛋白,蛋白注射到小鼠体内,从小鼠血管抽出
14、血液分离出蛋白的相应抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,2、鉴定个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,基因工程的操作程序,1.目的基因的获取,从基因文库中获取,PCR技术扩增,人工合成,基因组文库,部分基因文库,逆转录法,化学合成法,2.构建基因表达载体,如何构建基因表达载体,基因表达载体组成,3.将目的基因导入受体细胞,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,4.目的基因的检测,分子水平鉴定,个体水平鉴定,DNA-DNA分子杂交,DNA-mRN
15、A分子杂交,抗原-抗体分子杂交,基因表达载体作用,基因工程的应用,一、植物基因工程硕果累累,植物基因工程技术主要用于哪些方面?,1、提高农作物的抗逆能力： 如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等 2、改良农作物的品质 3、利用植物生产药物,植物基因工程的成果,抗虫转基因植物,抗病转基因植物,抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质,Bt毒蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因 植物凝集素基因,抗病毒基因,抗真菌基因,病毒外壳蛋白基因 病毒的复制酶基因,几丁质酶基因 抗毒素合成基因,调节渗透压的基因,抗冻蛋白基因,抗除草剂基因,将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物或改变必需氨基酸合
16、成途径中某种关键酶的活性,二、动物基因工程前景广阔,1.提高动物生长速度：,将外源生长激素基因导入动物体内,2.改善畜产品品质：,将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组内，降低牛奶中乳糖含量,3.用转基因的动物生产药物,乳腺生物反应器,4.用转基因动物作器官移植的供体,利用基因工程对猪的器官进行改造,将 与 等调控组件重组在一起，通过 方法，导入哺乳动物的 中，将 送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。,药用蛋白基因,乳腺蛋白基因的启动子,显微注射等,受精卵,受精卵,3.用转基因的动物生产药物,思考：为什么能用乳腺生
