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1、细菌转化,单克隆挑选及摇菌细菌转化,单克隆挑选及摇菌 1.接种 50100ul 菌液于 5 ml LB 试管中, 37 250 转/分 震荡约 3 小时,至 OD6000.2-0.6 时停止振荡(透过管能看到手指要挑选细 菌活力强时) 2、取 1.5ml 离心管与菌液放冰浴冷却 15min 3.将细菌转移至 1.5mL 的离心管中,4,4000 转/分离心 15min (防止菌体破裂) ,弃上清液 4.以 1ml 0.1M(0.2 倍菌液体积)预冷的 CaCl2 重悬细菌沉淀,冰浴 30min,4,4000 转/分离心 15min,弃上清液 5.用 250l(0.05 倍菌液体积)预冷的 Ca
2、Cl2 重悬细菌沉淀 6.1ng 质粒 DNA 加入到感受态细菌中, 轻轻旋转几次以混匀内容物, 冰上放置 30 分钟 7.将离心管放入 42的循环水浴中,90 秒 8.将离心管置于冰上,10 分钟 9.加入 200ulsoc 培养基 (加入了葡萄糖等物质, 比 LB 培养基更营养, 更利于热激后细菌恢复) ,200 转 3745min,同时将培养平板放入 孵箱 10.用一无菌玻璃推板轻轻将转化的细菌均匀地涂于培养基上。 (玻璃 推板充分火焰消毒,待充分冷却后再进行涂板,可将推板贴在平板盖 内侧,再用手隔板盖感觉温度) 11. 37培养箱中正置平板,待液体完全干后再倒置平板,培养 16 小时,
3、 将平板取出 4放置约 2 小时后观察。 挑选单个肉眼能见菌落, 坐上在平板上做上标记(菌落不易太大,否则有杂菌混入,培养箱中 培养不超过 16 个小时) 12、 在超净台内, 将细菌挑入 LB 培养基, 一个菌落一支管, 180200 转/分钟过夜(1216 个小时,以菌体浑浊为佳) 。抽取质粒(抽取质 粒时每支 LB 管也应对应相应的 EP 管) 备注 LB 培养基制备 蛋白胨 1%(g/ml) NaCl 1% 酵母粉 0.5% 到此配方为 LB 培养基(液体) 若配制平板则加 琼脂粉 1.5% 氨苄青霉素的储存浓度是 50100ug/ul,使用时稀释 1000 倍, 以下步骤在超净台进行, 培养液高压灭菌后, 待容器不烫手时加入氨苄, 轻摇混匀, 倒入平板, 每板大约 20ml