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1、分子生物学复习题实验一 DNA 的制备（1）为什么分子生物学实施时要担心 EB？溴化乙锭（Ethidium bromide）是 DNA 诱变剂，溴 化 乙 锭 可 以 嵌 入 碱 基 分 子 中 ， 导 致 错 配 。 具 有 高 致癌 性 (接 触 致 癌 )（2）DNA 加样缓冲液的用途是什么？由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类) 对 DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇 )以降低这些酶类的活性。（3）DNA 电泳时所用的琼脂糖凝胶其浓度是如何决定的？1 核 酸 分 子 大 小 与 琼 脂 糖 浓 度 的 关 系 （ 2） 琼 脂 脂
2、糖 的 浓 度 不 同 大 小 的 DNA 需 要 用 不 同 浓 度 的 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 分 离 。 琼 脂 糖 浓 度 与 DNA 分 离 范 围 琼 脂 糖 浓 度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线 状 DNA 大 小 /kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1（4）琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的原理是什么DNA 分子在 pH 值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA 分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于 DNA 分子可片段的相对分子质量不同，移动速度
3、也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的 DNA 分离。D NA 片 段 迁 移 距 离 （ 迁 移 率 ）与 碱 基 对 的 对 数 成 反 比 ， 因 此 通 过 已 知 大 小 的 标 准 物 移 动 的 距 离 与 未 知 片 段 的 移 动 距 离 时 行 比 较 ，便 可 测 出 未 知 片 段 的 大 小 。 但 是 当 DNA 分 子 大 小 超 过 20kb 时 ， 普 通 琼 脂 糖 凝 胶 就 很 难 将 它 们 分 开 。此 时 电 泳 的 迁 移 率 不 再 依 赖 于 分 子 大 小 ， 因 此 ， 就 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 DNA 时 ， 分
4、 子 大 小 不 宜超 过 此 值 。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中 DNA 是靠什么发出荧光的？为什么？溴化乙锭是 一 种 高 度 灵 敏 的 荧 光 染 色 剂 ,可插入 DNA 双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在 254nm 波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测 DNA，可检出 10-9g 以上的DNA 含量。（6）制备基因组 DNA 时用到的以下试剂分别起什么作用？CTAB 等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使 DNA 得以游离出来氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液
5、中除去细胞碎片和大部分蛋白质。无水乙醇上清液中加入无水乙醇使 DNA 沉淀，沉淀 DNA 溶于 TE 溶液中，即得植物总 DNA 溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁实验二 RNA 的制备1.制备 RNA 时通常要注意些什么？为什么？应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入;由于 RNA 分子的结构特点，容易受 RNA 酶的攻击反应而降解，加上 RNA 酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止 RNA 酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。2.制备的 RNA 通常有哪些用途？制备的 DNA 通常又有哪些用途？研究基因的表达和调控时常
6、常要从组织和细胞中分离和纯化 RNA。质粒 DNA 构建克隆载体,分离目的基因3.RNA 制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断 RNA 质量好坏？为什么？1.2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外检测仪下观察，完整的总 RNA 样品应呈现三条带：28S 、18S、和 5S rRNA。其中 28S rRNA 条带的亮度应该为 18SrRNA 条带的 1.52 倍。反之，说明部分 28S rRNA 已经降解成 18S rRNA。若无清晰条带，则说明样品 RNA 已严重降解。若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有 DNA 污染。4.RNA 制备好后通过什么方法测定其含量？RNA 通
7、常用分光光度计测量，通常在 A260 的读书在 0.15-1.0 之间才是可靠的，A260 为 1 相当于 RNA的浓度为 40 微克/ml实验三 质粒 DNA 的制备1.什么是质粒？质粒有什么主要用途？染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链 DNA 分子（cccDNA） ，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 用途: 把 一 个 有 用 的 目 的 DNA 片 段 通 过 重 组 DNA 技 术 ， 送 进 受 体 细 胞 中 去 进 行 繁 殖 和 表 达 的 工 具叫 载 体 (Ve
8、ctor)。 细 菌 质 粒 是 重 组 DNA 技 术 中 常 用 的 载 体 。2.分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？1 环状 DNA 分子能够自我复制，或整合到染色体上，随染色体复制。2 有多个限制酶切点(便于切割 )3 有标记基因(便于进行检验)3.制备的质粒 DNA 在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？哪种条带形式的质粒DNA 其转化或转染效率最高？三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 实验四 感受态细菌的制备及质粒 DNA 的转化（1）什么是感受态细菌？感受态细菌的主要用途是什么？感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为
9、能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。感受态细菌吸收异源 DNA 分子，使受体细胞获得新的遗传性状. （2）什么是转化？转化与转染的主要区别是什么？转化（transformation)感受态细菌捕获质粒 DNA 的过程转染（transfection)细菌捕获噬菌体 DNA 的过程（3）有哪些主要因素决定质粒 DNA 的转化效率？1.细菌的生长状态和密度：OD006=0.30.5 细菌出于对数期或者对数前期2.质粒 DNA：数量：质粒 DNA 不超过感受态细胞体积的 5% 大小：分子量越大转化效率越低，超过 30Kb 的质粒 DNA 很难转化成功构型：超螺旋的 DNA 具有较高的转化效率，重
10、组 DNA 效率低一些，环状 DNA 相比线性 DNA 转化效率高一些3.所用试剂纯度、质量、器皿的洁净程度4.防止杂菌和其他外源 DNA 的污染（4）质粒 DNA 的转化过程可分为哪几个阶段？每个阶段中主要发生了什么事件？1 吸附阶段：完整的双链 DNA 分子吸附于感受态细胞表面。 2 转入阶段：双链 DNA 分子解链，以单链形式进入细胞，而另一链则被降解。3 自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型 DNA4 表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被转录及翻译。（5）什么是转化子？什么是非转化子？转化子：带有异源 DNA 分子的受体细胞非转化子:不带有异源 DNA(质粒) 分
11、子的受体细胞实验五 质粒 DNA 的酶切与鉴定（1）限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链 DNA的核酸内切酶。限制性内切酶天然存在于细菌体内（2）什么是细菌的限制-修饰系统？限制 -修饰系统对细菌有什么用途？限制性内切酶,与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-Modification System） 。用途:降解外来 DNA 分子，以限制（ restriction）或阻止病毒侵染，是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。（3）限制性内切酶有几类？这几类限制性内
12、切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么？型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需 Mg2+、ATP 和 S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）应用：不常用。型限制性内切酶功能：功能：识别并特异切割 DNA 分子, 即通常所指的 DNA 限制性核酸内切酶。特点：仅需 Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链 DNA 的特殊序列，并可特异切割 DNA，产生特异性的片段。应用：种类繁多,分子克隆最常用的内切酶。型限制性内切酶限制、修饰特点：需 Mg2+、ATP 和 S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3端
13、24-26bp 处应用：数量很少，分子克隆中无实际作用（4）限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？II 型限制性核酸内切酶的识别序列通常是对称的，识别位点序列长度为 4-8 个核苷酸对。这种对称序列称为回纹序列（palindrome） 。（5）酶通常在什么温度中保存？为什么酶在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？限制性内切酶需保存于-20，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。限制性内切酶溶液通常含有 50%甘油（6）1 个单位（1 U）的限制性内切酶代表什么意思？酶活力单位的量度。1961 年国际酶学会议规定：1 个酶活力单位是指在特定条件（25
14、，其它为最适条件）下，在 1min 内能转化 1mol底物的酶量，或是转化底物中 1mol的有关基团的酶量。实验六 目的基因的 PCR 扩增（1）PCR 反应液中主要成分是哪些？在 PCR 反应过程中各起什么作用？DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的 DNA 引物、耐热 DNA Taq 聚合酶。（2）为什么在 PCR 反应过程中，使用三个不同的温度变化？高温变性、低温退火、中温延伸 3 个阶段。1、变性：加热使模板 DNA 在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2、退火：在体系温度降至 37-65，模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结
15、合，使引物与模板链 3端结合，形成部分双链 DNA，即退火阶段。3、延伸：体系反应温度升至中温 72，耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP） ，按 5到 3方向复制出互补 DNA，即引物的延伸阶段。（3）用 PCR 扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？由于 PCR 灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量 DNA 的污染。1. 所有与 PCR 有关的试剂，只作 PCR 实验用，而不挪作它用。2. 操作中所用的 PCR 管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。3. 每加一种反应物，应换新的枪头。实验七
16、DNA 重组及转化实验（1）什么是 T-载体？聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧 3端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于 PCR 产物两侧3端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与 T 载体之间的 A-T 互补性可提高 PCR 产物克隆的效率。（2）什么是 T-A 克隆？TA 克隆方法（Original TA Cloning Kit）把 PCR 片断与一个具有 3-T 突出的载体 DNA 连接起来的方法。（3）T-A 克隆 DNA 重组实验的主要步骤有哪些？切,接,转,增,检（4）目前获取目的基因的常用方法有哪些？一直接获取目的基因：1、从供体细胞直接获取 （鸟枪法-用限制性内切酶处理 DNA）2、从基因组文库中获取二合成法获取目的基因：1、利用 mRNA 反转录形成2、人工合成即根据蛋白质的氨基酸的序列推导出 mRNA 的核糖核苷酸序列，再推导出 DNA 的脱氧核苷酸的序列，最后用化学合成法合成目的基因 3、PCR 扩增（5）蓝-白斑筛选的原理是什么？n 由 -互补产生的 L
