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1、生化分离技术：描述回收生物产品分离过程原理和方法的术语，是指从动植物组织培养液或微生物发酵液中分离、纯化生物产品过 程中所采用的方法和手段的总称。 生化分离过程是生物技术转化为生产力不可缺少的重要环节，其技术进步程度对生物技术的发展有着举足轻重作用，为突出其在生 物技术领域中的地位和作用，常称它为生物技术 的下游工程。,分离纯化过程的难点：目的产物在细胞或反应液中含量不高，杂质种类多，数量大；杂质性质与产物相似；产物稳定性不高。 生化分离技术的主要种类：沉淀分离（盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、非离子聚合物沉淀）；膜分离（透析、微滤、超滤、 纳滤、反渗透）；层析分离（吸附、凝胶、离子交换、
2、疏水、反相、亲和层析）；电泳分离（SDS-PAGE、等电聚焦、双向电泳、毛 细管电泳）；离心分离（低速、高速、超速离心分离技术），,生化分离的特点：成分复杂；含量甚微；易变性/易被破坏；具经验性；均一性的相对性。 预处理需注意的条件： 温度尽可能低 提取液的量要保证“充分浸入” 加入足量酚类吸附剂 加入足量氧化酶抑制剂 搅 拌转速要恰当 pH 控制在合适范围，一般 5.57,1,细胞的破碎：用一定方法（机械/物理/化学/酶法）打开细胞壁或膜，使细胞内含物有效释放出来。,挤压：微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎。 沉淀：溶液中溶质由液相变成固相
3、析出的过程。本质：通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在液相中的溶解度，增加固相中的分 配率。作用：分离、澄清、浓缩、保存,盐溶：低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大。 盐析：中性盐浓度增至一定时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀。 有机溶剂沉淀法 ：使溶液的介电常数大大降低，从而增加带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉淀；争夺酶、蛋白质等物质表面 的水分子，破坏水化层，使分子易碰聚产生沉淀。 沉淀条件讨论：1. 温度；2. pH ；3. 浓度；4. 离子强度；5. 有机溶剂的选择；6. 多价
4、阳离子的影响；7. 溶剂用量 膜分离或膜过滤定义：用天然或人工合成高分子薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对两个或两个以上组分的溶质和溶剂进行 分离、提纯和富集的方法。 膜：两相之间的一个不连续区间，是隔开两种流体的一个薄的阻挡层。 膜分离的特点：过程为常温过程；不发生相变；密闭系统中进行；产品不受污染；选择性好；适应性强；实现自动化操作。,2,项目,膜类型,操作压力 分离机理适用范围技术特点不足之处 0.01 MPa颗粒大小、含微粒或菌体溶 操作简便，通水量大，工 有机污染物的分,微滤对称微孔膜 (MF)0.0210m0.2 MPa形状液的分离作压力低，制水率高。离效果较差。 超滤 (UF
5、),不对称微孔膜 0.1 MPa 颗粒大小、有机物或微生物 0.0010.1m 0.5 MPa形状溶液的分离,与微滤技术相似。与微滤技术相似。,纳滤 带皮层不对称复 0.5 MPa 优先吸附、硬水或有机物溶 可对原水进行部分脱盐和 常需预处理，工作 (NF)合膜150 nm 2.5 MPa表面电位液的脱盐软化，生产优质饮用水。压力较高。,(RO)合膜1 nm10 MPa溶解扩散淡化,有机物、盐、微生物等。,反渗透带皮层不对称复 1.0 MPa 优先吸附、海水或苦咸水的 几乎可去除水中一切杂 工作压力高；制水,质，包括悬浮物、胶体、 率低；能耗大。,按膜断面的物理形态：表面活性层（ 0.11m，
6、分离作用，其孔径和性质决定膜的分离特性，厚度决定传质速度）；多孔支撑层 （100200m，机械支撑作用，对分离特性和传质速度影响很小） 表征膜性能的参数：孔的性质；水通量；耐压能力；pH 适用范围；对热和溶剂的稳定性；截留分子量分布 膜的劣化：膜本身不可逆转的质量变化（化学性：水解、氧化；物理性：固结、干燥；生物性：微生物代谢产物）。 污染膜是否清洗的判据：进出口压力降；透水量或透水质量；定时清洗。 污染膜的常用清洗方法 ：机械方法；加起溶解作用的物质；加起氧化作用的物质；加起渗透作用的物质；切断离子结合作用。 浓差极化：指外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，而大分子被截留于膜表面，并逐渐形
7、成浓度梯度的现象。 克服极化的主要措施：震动、搅拌、错流、切流。,膜分离的原理：利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质的差 别，对于各种薄膜表现出不同的可透性而达分离的目的。分子 透过膜可由简单的扩散作用引起或外加的流体静压差或电场作 用所推动。 透析Dialysis（DS）：除去或更换小分子物质；脱盐；改变溶剂 成分 透析膜的特点：亲水性，分子筛状多孔薄膜；化学惰性；一定 机械强度和良好的再生性能。 提高透析效果的措施：搅拌；定期或连续更换新鲜溶剂。 反渗透 RO 原理（毛细孔流动模型）：膜组成中含有亲水活性基 团，膜表面能选择性吸附水分子而排斥溶质分子，靠近膜表面 的浓度梯度急剧下降，从而在
8、膜和溶液的界面形成一层被膜吸 附的纯水层(厚度约 2 个水分子)，在反渗透压力推动下，纯水层 的水通过膜的毛细孔连续不断地渗出。 溶解扩散模型：把半透膜看成完全致密的中性界面，水和溶 质通过膜分为两个阶段：第一阶段：水和溶质被吸附溶解到膜 材质表面；第二阶段：水和溶质在膜中扩散传递而通过膜。 孔隙开闭学说：膜里无固定连续孔道，所谓渗透性指因聚合物 的链经常振动而在不同时间和空间内渗透的平均值而已。 氢键理论：水分子进入醋酸纤维膜的非结晶部分后，因和羧基 的氧形成氢键而构成结合水，结合水的结合强度取决于膜内的 孔径，孔径越小结合越牢；牢固的结合水把孔占满，不与醋酸,3,纤维膜氢键结合的溶质就不能
9、扩散透过，但能与膜氢键结合的 离子和分子(水，酸)却能穿过结合水层而有序扩散通过膜。 临界孔径：膜表面孔径为吸附水层厚度 2 倍时，能获最大分离 效果和最高渗透通量。 超滤 Ultrafiltration UF：以超滤膜为分离介质，以膜两侧压力 差为推动力，将不同分子量的物质进行选择性分离。其用途： 大分子物质的脱盐和浓缩；小分子物质的纯化；大分子物质的 分级分离；生化制剂或其它制剂的去热原处理。 超滤膜的选择（主要考虑参数：截留分子量、流动速率）。 截留分子量：指截流率 90%以上的最小被截留物质的分子量（以 球形分子测定） 流动速率：一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量 (mL/cm2.
10、min) 其它：操作T、化学耐受性、膜吸附性、膜无菌处理 影响超滤流率的因素：（1）溶质分子的性质；（2）溶质浓度； （3）压力；（4）搅拌；（5）温度；（6）其它（溶液 pH、离子 强度及溶剂因素等） 超滤膜的截留机理：筛分作用：据分子大小、形态而分离。 超滤应用：浓缩和脱盐；分级分离与纯化；超滤分离与酶反应 器(或发酵罐)联用。 纳滤 Nanofiltration NF：介于超滤与反渗透之间的膜分离技术， 其截留分子量在 2002 000 的范围内，孔径为几纳米。能截留,2、吸附作用,凝胶：较硬，强度大,4,小分子有机物并同时透析出盐，集浓缩与透析为一体；在保证 一定膜通量的情况下，纳滤所
11、需压力比反渗透低得多，可节约 动力。 纳滤膜的分离机理：筛分作用（位阻效应）；离子与膜之间的静 电作用。 纳滤膜对盐的截留率主要由阴离子的价态决定。 反渗透的应用：海水和苦咸水的淡化；饮料用水和纯水制备； 果蔬汁和乳制品的浓缩。 微孔膜过滤 Microfitration MF：以多孔细小薄膜为过滤介质， 压力为推动力，使不溶物浓缩过滤的操作。 层析(色谱)：利用各组分与固定相亲和力或相互作差别实现分 离。 广义吸附 (Sorption) ：有选择地将一种或多种溶质从流动相转 移到固定相的过程，利用固定相和流动相间的相互作用将组分 分离开来。 Gel 的准备：（1）凝胶溶涨；（2）倾析；（3）控
12、制稠度；（4） 脱 气。 层析柱操作效果的影响因素：所用层析介质；洗脱剂的空柱流 速；柱孔隙率；层析介质的可渗透性能；组分在固定相和流动 相中的分配系数；处理量。 层析的两个基本问题：区带分离和峰形变宽。 层析分离效果常用两个目标峰的分辨率(RS)描述（分辨率：两,个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽的和 的平均值）。分辨率取决于：两组分的洗脱体积和峰宽；决定洗 脱体积和峰宽因素：层析柱的选择性和柱效 层析分辨率取决于：系统选择性、柱效率 N 和容量因子k。 k的取值与溶质在固定相和流动相的分配性质、温度及固定相 和流动相体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。 欲提高 RS 达到满意
13、分离效果，须满足的条件：（1）相对保留 值1；（2）理论塔板数 N 尽可能大；（3）k 0。 对极性组分：用极性较小溶剂溶解样品/上样/吸附；用极性较大 的溶剂作洗脱剂。 凝胶过滤层析原理：利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 据被分离物分子大小不同进行分离. 凝胶过滤层析优点：分离条件温和；样品回收率高；实验重复 性高；操作时间短，简便，经济 。 凝胶参数：排阻极限（用 A 类分子中最小分子量表示）；工作 （分级）范围（B 类分子的分子量范围）。 溶质洗脱的异常：分配系数 Kd 1 ：凝胶对溶质分子可能有吸附作用（疏水、 亲和、静电作用）,Gel 的定义：含大量液体的具有三维网状开孔弹性结构
14、的多聚体结构，一般制成球状颗粒。 Gel 的要求： 多孔、孔隙区大，内水体积 Vi 要大； 亲水； 惰性； 稳定； 色谱性能好。,交联葡聚糖（Sephadex）： （一）结构,骨架：葡聚糖（dextran） 主键：-1，6 糖苷键（约 95%） 分支：-1，3 糖苷键（约 5%） 交联剂：环氧氯丙烷，以醚键交联,控制葡聚糖与交联剂比例可制造不同孔径凝胶 G - X 可表示型号，X 从 10-200 其数字表示：10g 干胶的吸水量mL （二）稳定性 1、化学性质：较稳定 其稳定pH 范围： 212,强酸下，凝胶糖苷键易水解 强碱下，羟基易氧化成酸 一般稀碱下相对稳定，可用稀碱清洗,2、物理性质
15、 对热较稳定，可进行高温灭菌 耐压性与凝胶型号有关 （三）色谱性能 1、总工作范围 分子量：100 Da 60 万 Da,离子性 芳香性（疏水） 聚丙烯酰胺（Bio-Gel p-x） 一）结构 单体：丙烯酰胺 CH2=CH-CONH2 交联剂：N,N-甲叉双丙烯酰胺 CH2=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2 型号Bio-Gel p-x 中，x 范围：2300 其中x=工作范围上限/1000 （二）稳定性 1、化性 稳定pH 范围 211 2、物性 同Sephadex （三）色谱性能 1、总工作范围：10040 万 2、吸附：离子 I 0.02 mol/L 交联丙烯基葡聚糖（Sep
16、hacryl） 一）结构 单体：烯丙基右旋糖苷 交联剂：N,N-甲叉双丙烯酰胺,型强碱性交换剂无pH 上限。,Pr 的上限，此即为静态容量。,5,型号：Sephacryl S-200，S-300，S-400，S-500，S-1000 型号愈高，孔径愈大，其分子量分离范围可查表 （二）稳定性,pH 211 较Sephadex 抗压,（三）色谱性能 工作范围：10007 亿 吸附性： I 0.05 mol/L 琼脂糖凝胶（Sepharose） 一）结构,-D-半乳糖和 3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的 线性多聚糖 糖浓度越大，网孔越小 型号：Sepharose 2B、4B、6B 表示糖浓度 2% Bio-Gel A 0.5150M 表示工作范围上限,稳定pH 范围 4.59.0 2、物性 抗热性：较差，只能在 045使用 抗压性：较好，与浓度有关 （三）色谱性能,总工作范围：1034107 (4000 万) 吸附性：I 0.02 mol/L,交联琼脂糖（Sepharose CL-XB） 结构 强碱条件下用 2,3二溴
