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1、微生物基本操作技术,中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC 姚 粟,内 容,微生物分类 微生物接种和培养 微生物的分离 微生物的鉴定 微生物保藏 质控微生物,一、微生物分类,一、微生物分类-微生物的进化和多样性,普遍性系统发育树,亲缘关系根据rRNA序列比较来决定。 G. J. Olsen and C. R. Woese, Ribosomal RNA: A key to Phylogeny in the FASEB Journal, 7:113-123,1993,一、微生物分类,原核生物 大小: 0.5-3 mm 形状: - 球型 (Sthaphylococcus) - 棒状(Escheri
2、chia coli) - 螺旋 (Rhodospirillum) 生长迅速，20min至几小时可繁殖一代 可利用多种碳源,真核生物 细胞器： 线粒体 内质网 高尔基体 液泡,一、微生物分类,http:/micro.magnet.fsu.edu/cells/animals/images/animalcell.jpg,http:/www.microscopy.fsu.edu/cells/procaryotes/images/ procaryote.jpg,原核生物,一、微生物分类,真核生物,一、微生物分类,一、微生物分类-多相分类,表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征 遗传（基因型
3、）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列,多相分类 Polyphasic Texonomy Technology,一、微生物分类-微生物的分类等级,“种”是微生物分类中最基本的分类单元。 “种” 的定义：一个种（基因型种）是有相似G+C组成并通过DNA杂交试验判断由70%或更大相似性的菌株的集合。,分类等级 界（Domain） 门（Phylum） 纲（Class） 目（Order） 科（Family） 属（Genus） 种（Species）,二、微生物接种和培养,二、微生物接种和培养,微生物接种定义 将微生物的纯种或含菌材料（如水、食品、空气、土壤、排泄物等）转移到培养基上，这个操作过程叫微
4、生物的接种。 接种工具 微生物接种技术分类 斜面接种 液体接种 穿刺接种 平板接种,二、微生物接种和培养,斜面接种 左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平； 右手先将棉塞（硅胶塞）拧转松动，再拿接种环； 用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上灼烧； 接种环灼烧灭菌后插入试管内，冷却、挑菌，转入另一斜面底部，沿斜面划曲线或直线。,二、微生物接种和培养,二、微生物接种和培养,液体接种 操作方法与斜面接种基本一致，只是将接种环送入液体培养基中时使接种环与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散； 塞上棉塞，轻轻摇动均匀； 如果菌种培养在液体培养基中，使用移液管或滴管接种。,二、
5、微生物接种和培养,三、微生物接种和培养,穿刺接种 用接种针调取菌种后，插入深层固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出； 此法用于厌气性细菌接种，检查细菌的运动能力。,二、微生物接种和培养,二、微生物接种和培养,平板接种 平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，以及活菌计数等； 平板接斜面：平板分散的单菌落接于斜面； 斜面接平板：点种法、划线法。,二、微生物接种和培养,三、微生物分离,微生物纯培养分离技术,纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。 获得纯培养物对微生物学研究至关重要。,微生物纯培养分离技术,涂布平板法 平板划线法 平板倾注法 稀释摇管法,液体培养基分离法 单细胞（孢子）分
6、离法 选择培养基分离法,涂布平板法,1、少量样品加到平板中央（0.1mL）； 2、玻璃三角涂棒浸入酒精； 3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却； 4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养。,涂布平板法,样品需适当稀释30-300CFU/mL,平板划线法,斜线法 曲线法 方格法 放射法 四格法,平板划线法,斜线法： 用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。,曲线法： 将挑取有样品的接种环
7、在平板培养基上作连续划线。,平板划线法,血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）,平板倾注法,对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。 培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。,稀释摇管法,适合厌氧菌的纯培养分离,无菌琼脂培养基试管加热 使琼脂熔化后冷却并保持在50左右,梯度稀释后的待分离菌株加入试管中,摇匀、冷凝,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌 液体石蜡和固体石蜡的混合物,培养后，菌落形成在琼脂柱的中间,液体培养基分离,不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。 稀释法是液
8、体培养基分离纯化常用的方法。 在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。,单细胞（孢子）分离,单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。 较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。 个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养 。 单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。,选择培养基分离,选择培养基特性 促生长能力 抑制能力 指示（鉴别）能力,选择培养基分离,传统选择性培养基 血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。
9、 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制G+细菌，有选择地促进G-菌生长，是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。,选择培养基分离,新型显色培养基 利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的培养基。,选择培养基分离,基于酶与底物反应的显色培养基技术,CHROMagar,Petrifilm 3M,Aerobic Co
10、unt Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate,基于酶与底物反应的显色培养基技术,四、微生物鉴定,四、微生物鉴定,多相鉴定（分类)（polyphasic taxonomy）是利用微生物从分子特性到生态特征的多种不同信息，综合表型和基
11、因型特征进行微生物分类鉴定的方法。,四、微生物鉴定-形态学观察,四、微生物鉴定-形态学观察,四、微生物鉴定-生理生化,四、微生物鉴定-生理生化,Division based on membrane composition: a) gram-negative have outer and inner membranes and a thin cell wall (Escherichia coli) b) gram-positive have no outer membrane, but have a thicker cell wall (Bacillus subtilis) c) neither
12、 gram- nor gram+ - no cell walls (mycoplasm),http:/www.med.sc.edu:85/fox/gram-st.jpg,http:/www.med.sc.edu:85/fox/bact-mem.jpg,四、微生物鉴定-生理生化,API (bioMerieux)(biochemical),四、微生物鉴定-生理生化,BBL Crystal (Becton Dickinson) 将传统的生化反应、酶底物呈色反应与荧光增强显色技术结合，设计鉴定反应最佳组合。 六类鉴定试验板，可鉴定500种细菌,四、微生物鉴定-化学成分分析,四、微生物鉴定-基因型分析,
13、G+Cmol% 16S rDNA, 26S rDNA D1/D2, 5.8S rDNA ITS region, -tubulin gene, calmodulin gene, gyrA gene, pheS gene, recN gene, rpoB gene and other housekeeping genes. DNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA) DNA-DNA hybridization RAPD, RFLP, AFLP, SSCP, Eric-PCR, BOX-PCR,
14、Rep-PCR , LAMP.,四、微生物鉴定-基因型分析,假丝酵母PCR-SSCP,副溶血弧菌ERICPCR,沙门氏菌REP -PCR,四、微生物鉴定-鉴定实例1,16S rDNA序列系统发育树,infB基因序列系统发育树,2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表,2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov.,2010年 USP将ATCC 16404 更名,2010年 WDCM 将ATCC 16404 更名,图：ATCC 16888和ATCC 16404的培养特征和显微形态 anos V
15、arga, Sandor Kocsube , Bea ta To th, et al. Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932,图: Rep-PCR条码系统发育树(DiversiLab平台) Figure 2: Dendrogram of Rep-PCR Bar
16、coding (DiversiLab Platform) . 注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-14,表 ITS序列特殊位点碱基差异 Table Difference of base position in ITS sequence,四、微生物鉴定-鉴定实例2,2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表,2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov.,2010年 USP将ATCC 16404 更名,2010年 WDCM 将ATCC 16404 更名,图: 基于曲霉黑色组-微管蛋白基因序列的N-J树 Figure : Neig
