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1、上海复星医学科技发展有限公司 呼吸道病毒 7 项检测 试剂 2011-1-10 上海复星医学科技发展有限公司 呼吸道病毒 7 项检测试剂 目录目录 1概述.1 2D3 Ultra DFA 试剂.2 2.1 D3 Ultra DFA 试剂规格.2 2.2 D3 Ultra DFA 试剂用途.2 2.3 D3 Ultra DFA 试剂特点和优势.2 2.4 D3 Ultra DFA 试剂实验操作步骤.3 2.5 D3 Ultra DFA 试剂实验结果判读.4 3D3 Ultra DFA 试剂竞争优势.5 3.1 检验的特异性和灵敏度 .5 3.2 市场竞争.5 附录 1 七种病毒检测的临床意义 .
2、7 附录 2 实验室所需设备清单（试剂盒中不含）.8 附录 3 进口荧光显微镜参数 .9 上海复星医学科技发展有限公司 1 1概述 日常生活中， 几种常见的呼吸道病毒往往给人们的工作和生活带来极大的不 便，有些甚至威胁到人们的健康和生命。在医院和急诊室中，这些呼吸道病毒也 常常是诊断和治疗的难题。 常见的呼吸道病毒包括：A 型（甲型）流感病毒，型（甲型）流感病毒，B 型（乙型）流感病毒， 呼吸道合胞病毒（ 型（乙型）流感病毒， 呼吸道合胞病毒（RSV） ，腺病毒，副流感病毒） ，腺病毒，副流感病毒 1 型，副流感病毒型，副流感病毒 2 型和副流感 病毒 型和副流感 病毒 3 型。型。在病毒检测
3、方法中，抗原检测抗原检测有其无法比拟的优势：1. 可以用于病 毒的早期诊断，这对治疗非常重要；2. 快速、简便的诊断方法，短时间内得出 结果，节省实验室的劳动力和成本。DHI 公司的 D3 Ultra DFA 试剂属于抗原检测 中的直接免疫荧光法直接免疫荧光法。该试剂可以同时筛查和鉴定出常见的 7 种呼吸道病毒。 D3 Ultra DFA 试剂主要的测试对象为婴幼儿和儿童，所以目标客户群体为： 儿童医院、妇幼保健院和有儿科的三甲医院。 上海复星医学科技发展有限公司 2 2D3 Ultra DFA 试剂 2.1 D3 Ultra DFA 试剂规格 D3 Ultra DFA试剂分为7项呼吸道病毒筛
4、查试剂和7项呼吸道病毒鉴定试剂。 检测病毒种类：A 型（甲型）流感病毒，B 型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病 毒（RSV） ，腺病毒，1、2、3 型副流感病毒。具体规格如下： 筛查试剂：10 mL，可用于 400 次测试 鉴定试剂：每项鉴定试剂 2 mL X 7，可用于 80 次测试 另外，每盒试剂中含有 40 x 浓缩洗液 25 mL，固定液 15 mL，正常鼠丙种球 蛋白试剂 10 mL（用于阴性质控） ，含有 7 种呼吸道病毒抗原的阳性质控板 5 块。 2.2 D3 Ultra DFA 试剂用途 D3 Ultra DFA 试剂能对疑似呼吸道病毒感染的患者进行快速的病毒筛查和鉴 定。及时、
5、准确地诊断对于病人的治疗非常重要，这主要体现在以下几点： 1、病毒治疗针对性强 金刚烷乙胺、瑞乐沙、奥司他韦（达菲）等是抗流感病毒的特效药。 RSV 和副流感病毒可以使用利巴韦林和免疫球蛋白进行治疗。 目前没有专门的抗腺病毒药物，主要采取支持疗法。 2、病毒治疗有时效性 大部分呼吸道病毒越早治疗效果越好。 比如，奥司他韦在体内的活性形式是一种强效的高选择性的流感病毒 NA 抑 制剂，它主要通过干扰病毒从被感染的宿主细胞中释放，从而减少甲型或乙型流 感病毒的传播。因此，在出现流感症状的 48 小时内使用奥司他韦才有用，过了 这个时间段后疗效甚微。 3、避免抗生素的滥用 病毒不同于细菌、衣原体、支
6、原体等原核生物，其对抗生素不敏感，不能使 用抗生素进行治疗。准确的诊断能帮助医生确定是否使用抗生素来治疗病人。 2.3 D3 Ultra DFA 试剂特点和优势 1、产品几乎覆盖了所有常见呼吸道病毒的诊断 2、采用直接免疫荧光法，较其他检测方法有较大优势（详见表一） 上海复星医学科技发展有限公司 3 3、实验步骤较简便，在短时间内能得出结果，从而帮助医生更好地治疗病人 4、使用质量优异的抗体，染色步骤仅需 15 分钟，大大节省了实验室的劳动力和 成本，同时提高了临床诊断的成功率，减少重复实验 5、可以监控感染的大规模流行 6、拥有强大的科研团队，不断研制和改进单克隆抗体 表 1、几种常用检测方
7、法的比较 检测方法优点缺点 病毒分离培养特异性高 耗时耗力，灵敏度 较低 酶联免疫吸附法较快速、简便有非特异性反应 间接免疫荧光法较快速有非特异性反应 抗原检测 直接免疫荧光法（D3 Ultra DFA 试剂试剂） 快速、简便，灵敏度 和特异性均较高 需要使用荧光显 微镜 血清学检测快速、特异性较高 对疾病初期诊断 没有太大帮助 分子生物学方法 较快速，灵敏度和特 异性均较高 操作繁琐，价格昂 贵 2.4 D3 Ultra DFA 试剂实验操作步骤 1、样品准备步骤： 将样本充分震荡混匀约 10-15 秒。 在 400-600 xg 转速下离心 5-10 分钟。 弃上清（如果预留上清可用于细胞
8、培养） 。 在沉淀中加 5 mL PBS 缓冲液（请使用普通请使用普通 PBS，不要使用试剂盒内配套的浓 缩洗液 ，不要使用试剂盒内配套的浓 缩洗液） ，充分震荡混匀约 10-15 秒。 在 400-600 xg 转速下离心 5-10 分钟。 吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀小心不要吸到沉淀。 重复步骤 4 到 6，直至黏液层被完全去除。 注意：一定要将黏液去除干净，否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。注意：一定要将黏液去除干净，否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。 在沉淀中加 0.5 到 1 mL 的 PBS 缓冲液。 用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。这个悬浊液可
9、 用于直接样本测试。 2、直接样本测试步骤： 在 2 孔或 8 孔板上的每孔内滴加 25 L 的细胞悬浊液。 上海复星医学科技发展有限公司 4 样本完全风干。 在 20C 到 25C，用预冷的 100%丙酮固定细胞约 5 到 10 分钟。注意：丙酮是 易挥发、可燃性物质，使用时请远离明火。 注意：丙酮是 易挥发、可燃性物质，使用时请远离明火。 从丙酮中取出载玻片并风干。 在固定并风干的细胞上滴加一滴 DFA 染色试剂（如图 1） ，使其完全覆盖细胞 （注意：注意：2 孔或孔或 8 孔板上有一孔是阴性对照孔，请勿滴加孔板上有一孔是阴性对照孔，请勿滴加 DFA 染色试剂染色试剂） 。 在呼吸道病毒
10、抗原对照板的每孔内也要滴加 DFA 染色试剂。抗原对照板包含 了被病毒感染的细胞和未感染的细胞，只能一次性使用。 在阴性对照孔内滴加正常鼠丙种球蛋白试剂，使其完全覆盖细胞。 将载玻片放于 35C 到 37C 的恒温箱内孵育 15 到 30 分钟， 为保持其湿润最好 放置于带盖的盒子内。 用事先稀释好的洗液漂洗染色细胞。为了更有效地洗涤，请将玻片在洗液中 反复浸蘸 4 次左右。 使用新的 1X 洗液再洗一次。 用去离子水再洗一遍。 图 1、在玻璃板上滴加 D3 Ultra DFA 染色试剂 3、观察实验结果 滴加 2 到 3 滴固定液，并加盖盖玻片（20X50 mm） ，要注意避免产生气泡。 在
11、 200 倍放大荧光显微镜下观察结果。 2.5 D3 Ultra DFA 试剂实验结果判读 上海复星医学科技发展有限公司 5 带 FITC 标记的抗体在荧光显微镜下会呈现明亮的绿色，如果细胞表面存在 病毒抗原，染色后就会显绿色。在荧光显微镜下，感染不同病毒的细胞会呈现独 有的特征（如图 2） 。 图 2、显微镜下观察染色细胞（注 ： 根据不同荧光显微镜，背景色不一定为红色） 3D3 Ultra DFA 试剂竞争优势 3.1 检验的特异性和灵敏度 检验的特异性: 用 D3 Ultra DFA 呼吸道病毒筛查和鉴定试剂对多种细胞和 微生物进行交叉反应测试。 对 64 种病毒、 18 种细胞、 19
12、 种细菌均没有交叉反应。 检验的灵敏度 ： 荧光标记的单克隆抗体平均能检测出病毒的最低浓度约为 1. 0 PFU。 3.2 市场竞争 主要竞争对手为西班牙 Vircell 公司的 9 项呼吸道产品。D3 Ultra DFA 试剂与 其主要有两点不同：1. 检测项目不同；2. 检测原理不同 上海复星医学科技发展有限公司 6 1、Vircell 产品检测项目除了以上 7 种病毒外，还包含肺炎衣原体、支原体等原 核生物检测项目。但是，90%的感冒是由病毒引起的。如果是细菌、衣原体、支 原体等感染，一般白细胞和 C-反应蛋白（CRP）都会显著升高，而病毒感染，这 两项指标一般不会升高。 我们建议医生可以先做血常规或者 CRP 检测， 这样就能 区分是病毒还是细菌感染，而这两项测试不仅快速（一般 20-30 分钟） ，而且价 格相对便宜。 2、D3 Ultra DFA 试剂的检测原理是用荧光（FITC）标记的单克隆抗体检测病毒抗 原，属于直接荧光免疫法。Vircell 产品的检测原理是用抗原检测抗体（IgM） ，使 用的方法是间接免疫荧光法。虽然检测 IgM 能区分出是既往感染还是急性感染， 但是抗
