AKTA蛋白纯化系统操作（最新版-修订）新修订

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1、AKTA 蛋白纯化系统操作蛋白纯化系统操作 AKTA 蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA 系统 依据不同的配置， 可以分为 AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、 AKTA PURIFIER 等多种型号的设备。 以下以 AKTA EXPLORER 为例简单介绍AKTA 蛋白纯化系统的一般操作。 1、认识 AKTA。 AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的 分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1） 。它们是： pH/C 900 pH 电导检测器 UV-900 紫外检测器

2、190-700nm 任选三波长 P-900 系统泵 双泵，四泵头 储物盒和缓冲液托盘 FIG 1、AKTA EXPLORER 主机 Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。在 AKTAexplorer 100，流速范围 0.01-100 ml/min，压力高达 10 Mpa（泵名为 P-901） 。在 AKTA explore10，流速范围 0.001-10 ml/min， 压力高达 25 Mpa（泵名为 P-903） 。 Monitor UV-900， 同时监控190700 nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见 （UV- Vis）监测器。 （针对部分 AKTA PURIFIER 机

3、型，尚有 UPC-900 监测器可供选择，光源为汞灯 光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。 ） Monitor pH/C-900，在线电导和 pH 监测的组合监测器。 Fig 2、AKTA EXPLORER 硬件模式图 AKTA EXPLORER 系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2） 。组成部件，如混合器、 柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。 分离装置由 UNICORN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系 统之间的通信由数据采集装置 CU950 进行控制。 2、一般操作 2.1 开

4、机2.1 开机 按位于底部平台前左侧的 ON/OFF 按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪 器自检完毕（CU950 上面的 3 个指示灯完全点亮并不闪烁） 。双击桌面上 UNICORN 图标， 进入操作界面。UNICORN 的操作界面分为四个窗口（Fig 3） Main Manu 主菜单 Method Editor 方法编辑 System Control 系统控制 Evaluation 结果处理 Fig 3、Unicorn 的操作界面 2.2 准备工作溶液和样品2.2 准备工作溶液和样品 所有的工作溶液和样品必须经过 0.45m 的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清 备用。当缓冲液中含有

5、有机溶剂（如乙腈、甲醇） ，需在使用前用低频超声脱气 10min。 2.3 清洗及管道准备2.3 清洗及管道准备 首先将 A 泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将 B 泵的进液管道(B1)放入 高盐溶液中，在 system control 窗口点击工具栏内的 manual，选择 pumppump wash explorer，选中 A1,B1 管道为 ON， execute。泵清洗将自动结束。(Fig 4) Fig 4、AKTA Explorer 的泵清洗操作 2.4 安装层析柱2.4 安装层析柱 在 manual 里选择 pumpflow rate，输入一定的低流速（Fig 5） ，i

6、nsert；选择 Alarm&monalarm pressure，设置 high alarm（输入填料或层析柱的耐受压力，以较低 者为设置值，具体可在填料说明书或层析柱说明书中查到） ，insert，execute（Fig 6） 。待 InjectionValve 的 1 号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的 堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。 Fig 5、AKTA Explorer 的流速设定操作 Fig 6、AKTA Explorer 的限压设定操作 2.5 开始纯化：2.5 开始纯化： 1）在柱子平衡好之后（电导，pH 的数值和变化趋势稳定）即开始上样了。此时应 将紫外调零

7、（Fig 7） ，选择 Alarm&monautozero，exectue。 Fig 7、AKTA Explorer 的紫外调零操作 2）具体上样方式：AKTA 系统的上样方式比较灵活，可以根据具体样品的条件进行 上样，包括用样品环上样、用系统泵上样、用样品泵上样等，这里以用系统泵上样为例 简单介绍上样过程。点击 pause，将 A1 放入样品中，点击 countine，待样品上完后，再 将 A1 放入到平衡液中继续清洗柱子。 3） 洗脱 ： 上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。 在 manual 里选择 pumpgradient， 按照自己的工艺选择 targetB（100）和 length

8、（10CV） （Fig 8） 。 Fig 8、AKTA Explorer 的洗脱条件设定操作 4）设定收集：选择 Fracfractionation_900,输入每管收集体积，exectue（Fig 9） 。 结束固定体积收集选择 Fracfractionation_stop_900，exectue（Fig 10） 。 Fig 9、AKTA Explorer 的组分收集设定操作 Fig 10、AKTA Explorer 的组分收集停止设定操作 5）清洗泵及卸下层析柱： 将 A1 和 B1 入口放入纯水中，启动 pump wash purifier 功能冲洗 A 泵和 B 泵及整个 管路。然后再

9、将 A1 和 B1 入口放入 20乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。再 给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的时候将堵头 拧上，再拆柱子的上端，最后拧上上端的堵头。整个过程中应防止气泡进入。 6）关闭电源： 从软件控制系统的第一个窗口 unicorn manager 点击退出，其他窗口不能单独关闭。 然后关闭 AKTA 主机电源，关闭电脑电源。 3、程序设定操作 在 method editor 窗口点击工具栏内的 method wizard，弹出窗口界面如 Fig 11 所示，可 以分别在 main selection、column 以及 column pos

10、ition 三个下拉菜单中选择所要用到的层析 方法、 所用到的层析柱的参数以及所安装的层析柱在柱位选择阀的位置， 选好之后， 点击 next 按钮进入下一步波长和溶液进口的设定（Fig 12） ，在此可以设定检测的波长，针对 AKTA EXPLORER 可以一次选择三个波长共同进行监控，并在此设定 A 泵和 B 泵的溶液进口，设定 好之后，点击 next，出现如 Fig 13 所示窗口，可以在此设定对层析柱进行平衡的条件。 Fig 11 Fig 12 Fig 13 Fig 14 完成之后，点击 next 出现 Fig 14 的窗口，在此可以设定上样的条件，可选择的条件包 括上样的方式，如上样环

11、上样以及样品泵上样，对上样的体积也要进行设定。如果利用系统 泵上样， 在此无法进行设置， 不过可以利用 A 泵和 B 泵的两个进口在后面的步骤中进行设置。 在上步设置完成之后，点击 NEXT 出现如 Fig 15 所示窗口，这里是针对流穿组分收集所 进行一些设置，针对安装的不同的收集器，具体内容可能有些差异，这里显示的界面是在安 装了 Frac-950 收集器之后所出现的界面，设置完成点击 NEXT 出现如 Fig 16 所示的窗口，设 置目标组分收集的一些参数，点击 NEXT，出现如 Fig 17 所示的窗口，针对具体的洗脱条件 可以进行设置。 当全部设置完成之后，点击 finish，弹出

12、Fig 18 所示的窗口，可以再一次对所进行的设 置进行进一步的修改，完成之后点击按钮，完成程序存盘操作。至此完成洗脱程序的设 定工作， 在应用自动洗脱程序时， 可在SYSTEM CONTROL窗口点击文件菜单栏中的FILERun， 在弹出的对话框中选择目标洗脱程序所在的位置并执行， 之后会依次弹出一些对话框， 主要 是再次确认程序的设置条件，并选择洗脱结果文件的保存位置，全部设置完之后，洗脱将自 动进行，结果将自动的保存在设定的文件夹中。 Fig 15 Fig 16 Fig 17 Fig 18 4、结果的浏览与简单处理 在纯化完成后，Unicorn 软件会自动的按照预先的设置保存结果文件，如

13、果没有指定， 那么结果文件会保存于一个文件名以manual N开头的文件中， N为系统依次生成的一个1-10 之间的数字。 对于结果的浏览应在 evaluation 窗口（Fig 19）中进行，打开文件及对文件进行普通编 辑的菜单如 Fig 20 所示。 Fig 19 Evaluation 窗口 Fig 20 纯化结果普通编辑菜单 这里已经选择了一个纯化文件， 打开后， 在结果浏览窗口点击鼠标右键， 选择 properties， 可以弹出如 Fig 21 所示的操作菜单，可以分别对结果进行编辑，如改变曲线的颜色，设定横 轴或纵轴的显示区间，进行文本文件的编辑等等。 Fig 21 4、AKTA

14、蛋白纯化系统的日常维护 4.1 每天，当实验完成系统使用结束后，应尽可能避免保存于缓冲液中过夜，尤以高盐 浓度洗脱缓冲液为甚！假如，不能避免，则紧记次日尽早用 System Wash Method 完成以蒸馏水将系统彻底清洗，再予以保存或再更新使用其它缓冲液，再次投入使 用进行实验操作。用蒸馏水将余下的缓冲液彻底冲洗出系统，这步骤至关重要。此 举不但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会，甚或因使用高盐浓度缓冲液保存过久 造成盐结晶等的堵塞，对系统构成不必要的损害和损耗。 4.2 每周更换润洗缓冲液（20%乙醇） 。若发现储液瓶液体增多，就说明泵内部有漏液， 需要更换泵密封圈。若发现液体减少，需要检查润洗管接头，如果没有漏液，则泵 膜或密封圈需要更换。 4.3 一定要保持实验环境的清洁，以免灰尘造或泄漏的液体等造成仪器光学及电子元件 的损坏。 4.4 在长时间不应用系统进行试验的时候，应将系统管路充满 20%的乙醇，并关闭紫外 检测器，清洗 PH 探头，并保存于适当的缓冲液中。