《临床微生物检验_实验二》由会员分享，可在线阅读，更多相关《临床微生物检验_实验二（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、临床微生物学检验,实验 第二周,广州医科大学,实验内容,第一天：生物化学鉴定 葡萄糖、乳糖、VP、MR、硫化氢、 Indol、枸椽酸盐、双糖铁 第二天：生物化学鉴定 苯丙氨酸脱氨酶、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、DNA酶、硝酸盐还原、氧化发酵（O/F） 第三天：生物化学鉴定 氧化酶、触酶、DNA酶试验结果观察,目的要求,1. 掌握鉴别细菌常用生化反应的原理、结果判定及接种方法。 2. 熟悉鉴别细菌常用的复合生化培养基(KIA)的原理、结果判定和应用,第一天实验内容,试剂（微量生化管）： 葡萄糖、乳糖、VP、MR、硫化氢、Indol、 枸椽酸盐、KIA 以上各种生化微量管2支/人 菌种：大
2、肠埃希菌、肠沙门菌、阴沟肠杆菌、 福氏a志贺菌等 其他：砂轮、接种针、酒精灯,常用指示剂变色范围,指示剂 颜色改变 感应pH范围 酸碱 溴甲酚紫 黄紫 5.26.8 溴麝香草酚蓝 黄蓝 6.07.6 甲基红 红黄 4.46.0 中性红 红黄 6.88.0 酚红 黄 红 6.88.4,碳水化合物代谢试验,1、糖(醇、苷)类发酵试验 原理：细菌含发酵糖(苷、醇)类的酶不同， 分解糖（苷、醇）能力不同，代谢产 物不同，指示剂呈酸性或碱性反应。,指示剂为溴甲酚紫 结果： 产酸： 分解糖(苷醇)产酸， 培养基变黄色 产酸产气：培养基变黄且出 现气泡 无变化： ,原理：某些细菌在代谢过程中分解葡萄糖产生丙
3、酮酸，丙酮酸可进一步被分解为乳酸、乙酸、甲酸等，而使培养基的pH值下降至4.5以下，故加入甲基红指示剂出现红色（阳性）。有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质如醇、酮、醛、气体和水，则培养基的酸碱度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色（阴性） 原理：细菌在葡萄糖代谢过程中生成丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧后可产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化为二乙酰（丁二酮），进而与培养基内的蛋白胨的精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物，即VP反应阳性。,2、甲基红试验（MR）及VP试验,葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 混合酸(甲、乙、乳酸、 琥珀酸) KOH+
4、空气 甲基红指示剂 丁二烯醇 二乙酰 PH4.4红色 奈酚+肌酸 (MR+) 红色化合物 (VP+),培养基:葡萄糖蛋白胨水,VP试验,MR试验,试剂： 甲液：6%-萘酚酒精溶液。 乙液：40%KOH溶液、0.3%肌酐。 结果判定：阳性:红色 阴性:黄色/棕色 （再350.51小时后观察）,甲基红试剂： 结果判定：加入甲基红试剂1滴, 阳性:红色 阴性:黄色,- +,MR结果与VP结果相反,3、硫化氢试验,原理：细菌分解含硫氨基酸 (胱aa、半胱aa)生成H2S，遇醋酸铅Pb或Fe2+形成黑色PbS或FeS沉淀 培养基：硫化氢培养基 结果判定：培养基变黑,+ -,原理：细菌分解培养基中的色氨酸
5、，生成吲哚，吲哚可与试剂中的对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色 结果：反应结束加试剂数滴，两液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性,- +,4、吲哚试验,原理：以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，若细菌能利用这些盐作为碳源和氮源而生长，则利用枸橼酸钠产生碳酸盐，与利用铵盐产生的NH3反应，形成 （NH4）2CO3，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草酚蓝由草绿色变为深蓝色 结果: 阳性:蓝色; 阴性:绿色,5、枸橼酸盐利用试验,- +,培养基：枸橼酸盐培养基,6.克氏双糖铁培养基(Kligler Iron Agar,KIA),组成：无糖培养基+1份葡萄糖+10份乳糖 + 铁盐 +
6、酚红 营养 底物 底物 底物 指示剂,克氏双糖铁试验结果示意图,各种生化培养基接种的细菌,葡萄糖： 大肠埃希菌 、 沙门菌或志贺菌 乳糖： 大肠埃希菌 、 沙门菌或志贺菌 硫化氢： 大肠埃希菌或志贺菌 、 沙门菌 VP试验： 大肠埃希菌、阴沟肠杆菌 甲基红MR试验： 大肠埃希菌、阴沟肠杆菌 吲哚试验： 大肠埃希菌、沙门菌或志贺菌 枸椽酸盐： 大肠埃希菌或志贺菌或沙门菌、 阴沟肠杆菌 KIA： 大肠埃希菌 、沙门菌或志贺菌,每种生化试验每人均做！ 每个生化反应微量管分别接种两种不同的细菌！,课后作业,复习今天接种细菌的各种生化反应原理与结果 预习第二天的各种生化反应原理及结果观察,第二天实验内容
7、,试剂：苯丙、尿素、（赖氨酸、鸟氨酸、氨对）、 DNA酶、硝还、O/F 以上各种生化微量管 2支/人 O/F管 4支/人 菌种：大肠、变形、沙门、志贺、金葡、铜绿 其他：砂轮、接种针、酒精灯 观察昨天的生化反应结果并记录,- +,MR和VP加试剂后观察,加试剂后观察,乳（+） 葡（产酸产气）H2S(-),大肠埃希菌在KIA中结果,乳（-）葡（+）H2S(+),伤寒沙门菌在KIA中结果,乳（）葡（）H2S(-),志贺菌在KIA中生长结果,KA-+,KA-+,KA-,AA+-,原理：若细菌具有苯丙氨酸脱氨酶， 能将培养基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，苯丙酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色 加入苯丙氨酸
8、脱氨酶试剂:10%FeCl3 阳性:培养基与试剂接触处出现绿色 阴性:不变色 培养基：苯丙氨酸培养基,A B,+ -,1、苯丙氨酸脱氨酶试验,原理：细菌具有的尿素酶分解尿素产生氨(氨在溶液中形成碳酸铵)，培养基pH 培养基：尿素培养基 指示剂：酚红 结果： 培养基呈碱性 指示剂显红色+, ,A B,2、尿素酶试验,原理：不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下能分解称为氧化型，无氧条件下能分解称为发酵型,两种情况下均不分解的为产碱型。 结果判定:仅在没有覆盖石蜡油的一管分解糖产酸或产酸产气者属氧化型；两管均分解糖产酸或产酸产气者为发酵型；两管都不生长
9、者为产碱型。 指示剂：溴麝香草酚蓝或溴甲酚紫 培养基：Hugh-Leifson培养基,3、氧化发酵试验（OF）,氧化发酵试验（OF）,发酵型,A B C,氧化型,产碱型,4、氨基酸脱羧酶试验,脱羧酶分解氨基酸使脱羧生成胺、CO2，培养基变碱性。 -coo 赖氨酸 尸胺 -coo 鸟氨酸 腐胺 培养基：赖、鸟氨基酸脱羧酶及氨基酸对照培养基 结果： 对照管黄色 测定管紫色+,接种细菌后，在培养基中加入石蜡油！,原理：细菌如果能使硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与试剂中的对氨基苯磺酸生成对偶氮苯磺酸，对偶氮苯磺酸再与试剂中的-萘胺反应，生成可见的红色N-萘胺偶氮苯磺酸。 硝酸盐还原的过程可因细菌的不同
10、而异， 有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌使硝酸盐还原为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解成为氮，此时加入硝酸盐还原试剂不显色，但可以在培养基的小倒管中出现气泡，如假单胞菌等。硝酸盐或亚硝酸盐如果被还原成气体的终未产物如氮或氧化氮，就称为脱硝化或脱氮化作用。,5、硝酸盐还原试验,甲液：甲基-萘胺 乙液：对氨基苯磺酸 培养后加试剂：甲液、乙液各一滴 阳性:红色 阴性:无色 在无色的培养基中再加入锌粉，判定结果,硝酸盐还原试验,硝酸盐还原试验,DNA酶 原理： 长链DNA 寡核苷酸链 （可被酸沉淀） （可溶于酸） 方法：点种,- +,6、DNA酶试验,实验内容：各种培养基接种细菌,苯
11、丙： 大肠埃希菌、变形杆菌 尿素： 大肠埃希菌、变形杆菌 赖氨酸：伤寒沙门菌、奇异变形杆菌 鸟氨酸：伤寒沙门菌、奇异变形杆菌 对照管：分别接种伤寒沙门菌或奇异变形杆菌 DNA酶： 金葡菌、大肠埃希菌或铜绿假单胞菌 硝还： 大肠埃希菌或变形杆菌、铜绿假单胞菌 O/F： 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌,每种生化反应每个同学均做并分别接种两种细菌！,第三天实验内容,试剂：氧化酶、触酶、1%盐酸 菌种：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌、肠球菌 其他：砂轮、接种针、酒精灯,观察昨天的生化反应结果,OF试验 发酵型 氧化型, ,加入试剂后观察,苯丙氨酸脱胺酶试验,尿素酶试验 ,硝酸盐还原试验 ,在无色
12、的培养基中再加入锌粉,红色 （） 不产氮气,无色（） 产氮气,氨基酸脱羧酶 ,颜色与对照管一致的为阴性，颜色不同的则为阳性, ,DNA酶试验结果,加1%盐酸,1、氧化酶试验原理： 盐酸二甲基对苯二胺（无色） 紫红色的醌类化合物 OR 盐酸四甲基对苯二胺（无色） 蓝色的醌类化合物 方法：直接法、间接法（滤纸法、试剂纸片法） 结果：在10秒内呈紫红色阳性 注意事项：不宜用生锈的接种针或接种环 不宜用热的镊子夹取纸片 避免接触氧化性或还原性物质 试剂应新鲜配制，避光保存 阴阳性对照,氧化型细胞色素C 细胞色素C,氧化酶,氧化,oxidase test, ,原理：H2O2 H2O+ O2 试剂：3%的
13、H2O2，用于绝大多数触酶试验 操作：玻片法 注意事项：避免挑取血琼脂 避免接触氧化性或还原性物质 试剂应新鲜配制，避光保存,2、过氧化氢酶（触酶）试验 catalase test,触酶,触酶试验：玻片法, ,触酶试验：试管法,氧化酶试验：大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 触酶试验： 金黄色葡萄球菌 肠球菌,试验操作,每人均做！,思考题 1. 为什么氨基酸脱羧酶试验要接种氨基酸对 照管？对照管阴性为何呈黄色？ 2. 氨基酸脱羧酶试验管加石蜡油的原因是？ 3. 本次生化反应试验有哪些影响因素？,大肠埃希菌： 伤寒沙门菌： 福氏志贺菌： 阴沟肠杆菌： 金黄色葡萄球菌： 铜绿假单胞菌： 奇异变形杆菌： 粪肠球菌：,4. 归纳以下各菌在本次实验中各生化反应试验结果,
