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1、水质 粪大肠菌群的测定,（多管发酵法） HJ/T347-2007 四川省城镇供排水协会 曾蓉宁,2 水中微生物简介,自然界的水可分为地下水和地面水，除了地下深层水外，如湖泊，河流，海洋等各种地面水中都存在着各种各样的微生物。但它们所含的微生物种类，数量和分布都不相同。其中有些是“土生土长”的。另一些水生细菌是外来的，它们来自土壤，空气，垃圾，工厂废物或城市下水道污水。而来自下水道的微生物中，很可能含有人体肠道致病菌，例如霍乱，伤寒，副伤寒和痢疾等病原菌。,4 污水的细菌学检验,水质的细菌学检验主要包括两个常规项目：细菌总数和总大肠菌群。,5 总大肠菌群测定的两种方法,多管发酵法 滤膜法,6 粪
2、大肠菌群的定义,粪大肠菌群是总大肠菌群的一部分，主要来自粪便。在44.5温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。,7 适用范围,本标准适用于地表水，地下水及废水中粪大肠菌群的测定。,8 原理,多管发酵法是以最可能数（most probable number），简称MPN 来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的
3、倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。,9 培养基及试剂,本标准所用试剂除另有说明，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。,10,单倍乳糖蛋白胨培养液： 将10g 蛋白胨、3g 牛肉寖膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH 为7.27.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于115高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。,11,三倍浓缩乳糖
4、蛋白胨培养液： 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。（即按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液）,12,EC培养液： 成分： 胰胨 20克， 乳糖 5克， 胆盐三号 1.5克，磷酸氢二钾（K2HPO4）4克，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5克，氯化钠5克，蒸馏水1000毫升。 制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有 玻璃倒管的试管中。置高压蒸气灭菌器中，115高压灭菌器中灭菌20min，灭菌后pH应为6.9。,13 培养基的存放,在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低，温度低于30摄氏度的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且
5、要避免杂菌倾入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时应废弃不用。,14 测定步骤,1. 水样接种量的选择 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。 相对未受污染的水样接种量为10ml、1 ml、0.1 ml。受污染水样接种量根据污染程度接种1 ml、0.1 ml、0.01 ml、或0.1 ml、0.01 ml、0.001 ml等。,15,培养液的浓度和量的选择： 如接种体积为10 ml，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL或少于1mL，则可接种普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。,16,
6、2. 初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在370.5下培养24h2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。入在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。,17,注意： 加入水样时，先将培养管管口用酒精灯消毒一次，加入水样后再用酒精灯消毒一次，封口。,18,阳性的判别：既产酸又产气： 观察：24h小时后取出观察培养 管，颜色由紫色变为黄色和有 气泡产生两个方面才能判为阳性,19,3. 复发酵试验 轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转移到EC培养液中。在44.50.5下培养24h2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发
7、酵管必须在30分钟内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。,20 结果的计算,根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表2或表3中查得每升水样中的粪大肠菌群。 接种水样为100ml 2份，10ml 10份，总量300ml 时，查表2可得每升水样中粪大肠菌群； 接种5份10ml 水样，5份1ml水样，5份0.1ml水样时，查表3求得MPN指数，MPN值再乘10，即为1升水样中的粪大肠菌群；,21,举例： 某水样接种10mL 的5 管均为阳性；接种1mL 的5 管中有2 管为阳性；接种1：10 的水样1mL 的5 管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-
8、0，得知100mL 水样中的总大肠菌群数为49 个，故1L 水样中的总大肠菌群数为4910=490 个。,22,如果接种的水样量不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公式换算成每100mL 的MPN 值。,表2 大肠菌群检数表接种水样总量300mL(100mL2份，10mL10份),18,38,25 注意事项,灭菌 初发酵后以有阴、有阳稀释效果最好。 水样一定要摇均。 每个稀释倍数要求做5管。 接种环要求用酒精灯灼烧消毒，复发酵接种时每一管都要在酒精灯上灼烧消毒。,26 思考题,配制好的培养基保存多少时间？存放时应注意哪些事项？
9、,27,答：配制好的培养基不宜保存过久，以少量勤配为宜。已灭菌的培养基可在4100C存放一个月。存放时应避免阳光直射，并且避免杂菌侵入和液体蒸发。,28 填空题,1. 细菌采样玻璃瓶洗涤干燥后，要在 0C干热灭菌 或高压蒸汽 0C灭菌 min。 2. 对受污染严重的水体，可选择 方法测定其总大肠菌群数。 3. 总大肠菌群测定过程的复发酵试验中，接种完菌落后，应将发酵管置于 0C温度下培养 h。 4. 复发酵试验使用 培养基。,29,计算题： 某水样接种10mL 的5 管中有4管为阳性；接种1mL 的5 管中有3 管为阳性；接种1：10 的水样1mL 的5 管中有1管为阳性。求1L 水样中的总大肠菌群数为多少？,
