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1、李纪勤李纪勤 博士博士 上海欧易生物医学科技有限公司上海欧易生物医学科技有限公司 2014年年3月月27日日 医药领域医药领域miRNA/lncRNA 研究策略深度解析研究策略深度解析 从实验到分析从实验到分析 主要内容 miRNA研究进展研究进展 Biomarker研究 功能机理研究 lncRNA研究策略研究策略 lncRNA-染色质重塑 lncRNA-转录调控 lncRNA-明星分子/通路 ceRNA 2 miRNA研究进展 3 成熟、多样的miRNA研究技术！ Sequencing Agilent Affymetrix Qiagen Microarray 加尾法 染料茎环法 探针茎环法
2、qPCR miRNA Luciferase report vector miRNA mimics/inhibitor 4 miRNA研究现状 5 Circulating miRNA biomarker研究 Training Cohort Validation Cohort 差异表达miRNA 疾病 VS 正常 入组样本选取 miRNA筛选 目标miRNA 6 Mathematical Model 研究目的：研究目的：寻找肝癌血浆miRNA标志物 研究内容：研究内容： Discovery phase肝癌差异miRNA筛选 Training phase分析具有明显临床相关性的差异miRNA Val
3、idation phase数学建模及验证 上海中山医院 J Clin Oncol. 2011 Dec 20;29(36):4781-8. (IF=18.038) 7 肝癌血浆标志物肝癌血浆标志物 Discovery phase Agilent Human miRNA Microarray qPCR 8 Training phase Validation phase J Clin Oncol. 2011 Dec 20;29(36):4781-8 小结小结 1.样本选取： 血浆、血清、尿液、其他体液 具有随访资料 2.Discovery阶段： 小样本量（8例以上） 芯片、测序均可 3.Traini
4、ng/ Validation阶段： 大样本量（100例以上） qPCR 4.适用于肿瘤、药物敏感性、药物处理前后 5.其他biomarker研究：lncRNA 9 子宫内膜异位症血浆标志物子宫内膜异位症血浆标志物 Hum Reprod. 2013 Feb;28(2):322-30. (IF=4.67) 北京协和医院 Discovery Training 3例异位症患者 3例正常人 40例异位症患者 40例正常人 Agilent Human miRNA Microarray 10 小结小结 优势： 周期短：从接收样本到文章发表7个月 经费可以承受 后续： 扩大样本量验证 开展机理研究 11 调控
5、机理研究 感兴趣的 表型？ 重要 基因？ 寻找相关miRNA 差异miRNA 临床意义 功能研究 定量PCR miRNA芯片 PCR array二代 测序 Loss of function Gain of function miRNA-靶基因 机制研究 12 miR-34调控机理调控机理 年老小鼠 vs 年幼小鼠 端粒长度减少、细胞凋亡增加 靶基因Pnuts miR-34/pnuts互作调 控心脏收缩功能 Nature. 2013 Mar 7;495(7439):107-10. miR-34 13 年幼小鼠心脏 (6-8周) 年老小鼠心脏 (1820月) miRNA芯片筛选 差异 靶基因预测结
6、合 表达谱芯片 确定Pnuts miR-34a/pnuts 功能验证 C57BL/6 mice miR-34a 14 荧光素酶报告系统 功能缺失 小结小结 1.差异miRNA挑选： 去掉已有研究的miRNA 选取miRNA表达与表型明显相关的 2.靶基因选取： 多种靶基因预测软件联合使用(miRandaPicTarTargetscan) 结合mRNA表达谱芯片数据 3.miRNA芯片与mRNA芯片同步开展，节省研究时间，提升研究档次 15 miRmiR- -1 1调控机制调控机制 ( (哮喘哮喘) ) J Exp Med. 2013 Sep 23;210(10):1993-2010. (IF=
7、13.214) VEGF 下游靶基因Mpl VEGFmiR-1MplP- selectin effector pathway miR-1 16 CC10-rtTA-VEGF tg /WT 小鼠 miRNA芯片 筛选差异 VEGFmiR-1Mpl miR-1 下游靶基因Mpl 17 J Exp Med. 2013 Sep 23;210(10):1993-2010. Mol Cancer. 2013 Dec 9;12:155. (IF=5.134) miR-204调控机制（调控机制（EC） TrkB基因 HEC-1BshTrkB/HEC-1B IshikawaTrkB/Ishikawa 芯片筛选差
8、异 miRNA miR-204-5p TrkB靶miRNA 分析 miR-204-5p/ TrkB功能研究 互作验证 细胞实验 动物实验 miR-204-5p与预后 18 19 lncRNA研究进展 non-protein coding transcripts longer than 200 nucleotides lncRNA 20 lncRNA研究现状 源自Pubmed 截至2014.03.05 21 Nat Rev Genet. 2009 Mar;10(3):155-9. Nucleic Acids Res. 2012 Aug;40(14):6391-400. lncRNA功能 22 转
9、录调控 明星分子/通路 ceRNA 转录调控 明星分子/通路 ceRNA 实验思路 差异lncRNA筛选 样品的准备、处理和收集 目标lncRNA 染色质重塑 功能验证 临床意义分析 机制探讨 23 案例案例1 1：染色质重塑：染色质重塑 Breast Breast CancerCancer 研究主题：调控乳腺癌转移的lncRNA-HOTAIR 研究思路：1. 用Array筛选出HOTAIR 2. 临床研究确定HOTAIR的临床意义 3. 体外研究确定HOTAIR的肿瘤学功能 4. 机制研究确定HOTAIR对染色质结构调节 24 Nature. 2010 Apr 15;464(7291):10
10、71-6. 芯片筛选 确定HOTAIR为研究目标 入组样品选择 6例正常乳腺组织，8例原位肿瘤，6例肝转移性肿瘤 25 Nature. 2010 Apr 15;464(7291):1071-6. 功能研究 临床研究 HOTAIR调节染色体结构 Gain of function Loss of function 小室实验 体内转移 ChIP-chip Polycomb repressive complex 2 验证HOTAIR-PRC2机制 26 Nature. 2010 Apr 15;464(7291):1071-6. 将染色质的调节/表观遗传学作为lncRNA下游机制探讨首 选方法： ChI
11、P （ChIP-PCR，ChIP-chip，ChIP-seq， MeDIP等） 做为lncRNA间接机制研究，下游通路采用 “Loss of Function” 即可 小结小结 27 适用疾病类型：适用疾病类型： breast cancer lung cancer ovarian cancer colon cancer lung cancer kidney cancer brain tumor Acute Myeloid Leukemia Head and Neck squamous cell carcinoma stomach cancer Thyroid carcinoma lncRNA深
12、度数据挖掘深度数据挖掘临床预后分析临床预后分析 28 明星分子/通路 ceRNA 29 转录调控 染色质重塑 差异lncRNA筛选 样品的准备、处理和收集 目标lncRNA 功能验证 临床意义分析 机制探讨 实验思路 PNAS. 2014 Jan 21;111(3):1002-7. (IF=9.737) 药物处理药物处理 差异筛选与验证差异筛选与验证 功能研究功能研究 转录调控机制转录调控机制 30 案例案例2 2：lncRNA与转录调控与转录调控 PNAS. 2014 Jan 21;111(3):1002-7. 基因芯片筛选差异 表达差异 定量验证 敲降 lncRNA1992下 调TNF的表
13、达 TNF负反馈调节 lncRNA1992的表达 31 Pull down 分析 WB验证 急性川崎病 32 PNAS. 2014 Jan 21;111(3):1002-7. 小结小结 转录因子的确定转录因子的确定 Pull down实验质谱分析WB验证 转录调控网络分析预测转录因子RIP分析 33 lncRNA深度数据挖掘深度数据挖掘转录调控转录调控 LncRNAs 转录因子转录因子 FDR（假阳性（假阳性 率）率） 靶基因靶基因 靶基因名称靶基因名称 lincRNA:chr9:65651848-65652920 reverse strand CTCF 1.63E-71 Tap1 trans
14、porter 1, ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP) lincRNA:chr9:65651848-65652920 reverse strand CTCF 1.63E-71 Socs2 suppressor of cytokine signaling 2 lincRNA:chr9:65651848-65652920 reverse strand CTCF 1.63E-71 Gp1bb glycoprotein Ib, beta polypeptide lincRNA:chr9:65651848-65652920 reverse stran
15、d CTCF 1.63E-71 Dcxr dicarbonyl L-xylulose reductase lincRNA:chr9:65651848-65652920 reverse strand CTCF 1.63E-71 Sdcbp2 syndecan binding protein (syntenin) 2 lincRNA:chr9:65651848-65652920 reverse strand CTCF 1.63E-71 Rnase4 ribonuclease, RNase A family 4 lincRNA:chr9:65651848-65652920 reverse strand CTCF 1.63E-71 Inhba inhibin beta-A lncRNA-转录因子-靶基因 34 35 明星分子/通路 ceRNA 转录调控 染色质重塑 差异lncRNA筛选 样品的准备、处理和收集 目标lncRNA 功能验证 临床意义分析 机制探讨
