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1、第五章 发酵工艺条件的确定,主讲人：刘萍,第三章 发酵工艺条件的确定,第一节 培养基的选择和确定 第二节 培养条件的确定,第一节 培养基的选择和确定,一、培养基的营养成分 二、培养基的用途 三、发酵培养基的选择 四、培养基成分的营养与作用 五、培养基确定方法 六、正交试验在培养基确定中的应用,一、培养基的营养成分,微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。 所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发
2、酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。,微生物的营养来源,（1）能源 自养菌：光；氢，硫胺；亚硝酸盐，亚铁盐。 异养菌：碳水化合物等有机物，石油天然气和石油化工产品，如醋酸。,（2）碳源： 碳酸气； 淀粉水解糖，糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、正构石蜡，天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品,（3）氮源 豆饼或蚕蛹水解液，味精废液，玉米浆，酒糟水等有机氮 尿素，硫酸铵，氨水，硝酸盐等无机氮 气态氮,(4)无机盐 磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等其他矿盐 铁、锰、钴等微量元素 其他 （5）特殊生长因子 硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等,二、培养基的用途,筛选菌种 保藏
3、菌种 检验杂菌 培养种子 发酵生产,（一）、培养基的分类 （二）、发酵生产中的培养基类型,（一）、培养基的分类,（1）按培养基组成物质的化学成分 合成培养基、天然培养基。 （2）按物理性质 固体，液体 （3）按用途 选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等,（1）天然培养基 是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成的。 适合于各类异养微生物生长，而一般自养微生物都不能生长。,（2）合成培养基,是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精 确，重复性强，可以减少不能控制的因素 适用于在实验室范围作有
4、关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。 但一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长。,（3）半合成培养基,多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。 大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此，在微生物工业生产上和试验研究中被广泛使用。,（1） 液体培养基：常用于大规模的工业生产及生理代谢等基本理论研究工作。 发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。 根据微生物对氧的要求情况，分别作静止或通风搅拌培养。 在菌种筛选工作和菌种培养
5、工作中，也常用液体培养基进行摇瓶培养 微生物在液体培养基中生长的情况有时也可用作鉴定菌种的参考。,生理代谢 菌种筛选,种子培养,发酵培养,（2） 固体培养基 分类：斜面试管、平板等 是在液体培养基中加入凝固剂配成的，最常用的凝固剂是琼脂。,作用： 固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和鉴定菌种方面是不可缺少的。 在制曲、酶制剂、柠檬酸等生产中，用来培养霉菌等的固体种子和发酵培养基是由麸皮等农作物加无机元素等制成的。,增殖培养基：可以配制成适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。 鉴别培养基：是根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，借助
6、指示剂的显色反应，以鉴别不同种类的微生物。 选择培养基：是在培养基内加入某种化学物质以抑制不需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。,（二）、发酵生产中的培养基类型,工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为： 斜面培养基 种子培养基 发酵培养基 摇瓶培养基,1斜面培养基,作用：这是供微生物细胞生长繁殖用的，包括细菌，酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸曲培养基等。这类培养基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养物质。,特点： 1.富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。 2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和碳源均不宜太丰富，否则容易
7、长菌丝而较少形成孢子。 3.斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的生长因子和微量元素。,2种子培养基(包括摇瓶种子和小罐种子培养基)：,培养种子的目的： 1.扩大培养，增加细胞数量； 同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。,种子培养基特点： 1. 必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。 2. 种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。 3. 种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。,3发酵培养基,发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料
8、，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。 （1）根据产物合成的特点来设计培养基： 对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。,（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。 （3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。,三、发酵培养基的选择,(1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 (2)有利于减少培养基原料的单
9、耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。 (3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。 (4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。,(5)尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。 (6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。 7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。 (8)有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。,发酵培养基的设计和注意事项,1提供必要的营养成分：培养基成分必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求。 2配制合适的浓度：可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致
10、推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。 3. 主成分与其他成分的配比。,4控制合适的pH：微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要定的pH环境，在最适pH值下有利于加快各种酶的反应。因此在整个发酵过程中应使培养基的pH适合于微生物生长或产物合成所需。,pH的具体控制方法 1. 可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH，但更应在配制培养基时考虑所用营养物质的组成成分，使其pH值适合该微生物生长或合成代谢产物的需要。 2. 还要注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况.,3. 控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物，如以磷酸盐作为磷的
11、成分；或者避免使用容易产生生理酸性或碱性使培养基pH波动太大的物质。,4避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀 葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。这种物质不被微生物利用。因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌，而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。 硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙，因此二者也不宜直接配成培养基。,5注意代谢调节物的影响： 有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。 前体物质 诱导剂 阻遏物 抑制剂 金属离子,(1)添加有关前体物质：,前作物质：是指当添加到发酵培养基中的某些化学物质基本上不改变其分子结构而直接进入产物中的小分
12、子物质，从而在一定条件下控制产物的合成方向和提高产量。 在发酵中添加前体物质将有利于产物的合成和显著提高产量，如苯乙酸及其衍生物被认为是青霉素的前体物质。,(2)添加诱导物：,目前工业用微生物酶多数为诱导酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。 诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。 酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物。 在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导物，例如淀粉、糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化酶的诱导物。只有添加这些物质的培养基，才能获得高产。,(3)注意阻遏物或抑制剂的影响,培养基中存在反馈阻遏物或分解阻遏物均能影响酶的合成，降低发酵产量。 有些酶的抑制剂却能提高某些代谢产物的产量
13、，最早利用抑制剂提高中间代谢物产量的例子是甘油发酵中加入亚硫酸钠。 在培养基配制时必须注意加入有益的抑制剂，而避免混入有害的抑制物。,6. 金属离子的影响： 有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感，因为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活剂。 因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用，而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的，这些在培养基配制时都必须予以注意。,四、培养基组成物质的营养与作用,碳素化合物 氮素化合物 水 微量元素(无机盐类) 生长因子,碳素化合物营养源对微生物生长发育的影响,(1)碳素化合物的作用 构
14、成菌体成分的重要元素， 产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料， 同时又是化能异养型微生物的能量来源。,（2）碳源种类 糖：单糖中的己糖，寡糖中的蔗糖、麦芽糖、棉子糖，多糖中的淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等，其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。 有机酸如糖酸、柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸等。,醇类中甘露醇、甘油、低浓度的乙醇。 脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸都可用作碳源。油酸和亚油酸等高级脂肪酸可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用，低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长，但浓度较高时往往有毒害作用。 正烷烃：一般是指从石油裂得到的14C至18C的直
15、链烷烃混合物。,葡萄糖： 是最易利用的糖，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。 过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要。,糖蜜：是制糖厂生产糖时的结晶母液，是蔗糖厂的副产物。含有较丰富的糖、氨素化合物和无机维生素等，是微生物工业的价廉物美的原料。 淀粉：一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。可克服葡萄代谢过快的弊病。来源丰富，价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀。,油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，氧化成水和CO2。因此用脂肪作碳源时需比糖代谢供给更多的氧。,(2)氮素化合物,氮是构成微生物细胞蛋白质
16、和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分。氮素一般不提供能量，但硝化细菌却能利用氨作为氮源和能源。 就某一类微生物而言，由于其合成能力的差异，对氮营养的需要也有很大区别。,氮的来源可分为无机氮和有机氮： 有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。 它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。,有机氮源特点： 含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸 还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及生长因子。,玉米浆：是玉米淀粉生产中的副产物，其中固体物含量在50。还含有有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素。 由于玉米浆的来源不同，加工条件也不同，因此玉米浆的成分有较大波动。,无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等。 微生物对其吸收利用比有机物快，所以也称速效氮。 利用无机氮时应注意引起的pH变化。,实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等作为有机氮源，工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸
