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1、建立分析方法,色谱分离度与分离性能,HPLC分离的机理,色谱工作者关心的基本问题 - 色谱峰之间的分离度,to,tRA,mAU,time,tRB,R = 分离度 tRA = 组分A的保留时间 tRB= 组分B的保留时间 w = 峰的基线宽度 w1/2=半峰宽,分离度值,等梯度洗脱的基本分离度公式,影响分离度的因素,容量因子对分离度的影响,容量因子 - 流动相组成的影响,选择性,影响选择性的参数,有机成分含量低的固定相 有机成分含量高的固定相,色谱柱温度对分离度的影响,柱效,计算柱效,典型的流速值,柱内径 mm(5um 粒度),mL/min,柱外体积的影响,Time, min.,2.1 x 15
2、0 mm F = 0.2 mL / min.,所需分离度与柱长匹配,峰对称性,提高分离度,分离度与 k, n 和 的关系,液相色谱流动相及固定相,流动相,与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一起参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。 1、 理想的溶剂应有下列特性 1）化学稳定性好，与固定相不互溶、不发生反应 2）必须和检测器相适应 使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长 使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别,3）对待测物具一定极性和选择性 4）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；尽量避免使用有显著毒性的溶剂
3、5）适宜的粘度 粘度过高，柱压增加 过低（例：戊烷、乙醚等），易产生气泡,2、溶剂的极性 溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，表示溶剂的洗脱能力越大。,3、流动相的选择 4、梯度洗脱 特点：可以缩短总的色谱周期，提高分离效能，改善峰形，减少拖尾，可以增加灵敏度，会引起基线漂移,固定相,化学键合固定相 方法：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成柱填（约有3/4以上分离问题是在化学键合固定相上进行） 特点：稳定、流失小、适于梯度淋洗 分离机理：兼有吸附、分配两种分离模式。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。,载体主要是硅胶（表面有硅醇基）
4、,特点为： 可以制备成粒度分布窄的多种粒度 机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床 长期高压操作下不变形 反压较低、柱寿命长 较其它材料制成的柱有更高的柱效 适用于小分子、大分子的分析和制备 高pH值下会分解（pH8）,键合方法： （l）硅酯化（Si-O-R）键合固定相 （2)硅氮型（=Si-N=）共价键合固定相 （3）硅烷化（ Si-O-Si-R）键合固定相 使用键合固定相应注意的问题 硅胶键合相的稳定性 键合相色谱分离的重现性 键合相色谱分离的选择性 键合相色谱柱的再生,化学键合相色谱法,正相色谱和反相色谱,反相色谱的定义：在非极性的固定相上，用极性较大的液体作流动相进行物质分离分析的方
5、法。即：反相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性 正相色谱的定义：在极性的固定相上，用极性较小的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性,正相色谱和反相色谱,正相色谱和反相色谱的差别：,正相键合相色谱法,固定相：正相色谱中采用极性键合固定相，是把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反应，生成表面具有胺基、腈基、醚基的极性固定相。,流动相： 在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，
6、但随流动相极性的增加而降低。 主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。,反相键合相色谱法,采用非极性键合固定相,是把全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后,和含有烷基链或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基(或苯基)的非极性固定相，如C18、C8,流动相： 流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等 具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点,硅胶-烷基
7、键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响,分析方法建立,分析时要了解的情况,想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA- 仪器制造商的文献 充分了解自己的样品 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法,分析时要了解的情况（续1）,灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?,分离(制备)时要了解的情况,要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度
8、的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?,什么化合物参数能用于分离 ?,分子量不同/MW 2000 凝胶渗透 / 凝胶过滤离子化分子 离子对/ 离子交换 极性不同 吸附/ 反相色谱 同系物 / 苯系物 反相 中性、酸和碱的混合物反相 生物分子 亲和/HIC/凝胶过滤/反相 立体异构体 吸附 手性化合物 手性色谱,结构数据,数据收集,一般的具体步骤,先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k 值改变保留值 调节值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度,记住,每次改变一个参数,使用文献方法注意点,色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流
9、动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）,色谱方法转换,如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速,常规样品分离的系统方法,总的指导原则,改变可以明显改善选择性的条件 避免会影响方法普适性的实际问题 减少必要的实验次数，尽可能地利用计算机模拟 选择适用于各种常规试样的实验，以便采用同样的方法建立未知样品（离子的或中性）的HPLC分析方法 先做简单易行的 实验（改变色谱柱、改变pH、使用复杂的混合溶剂等属于比较难做的条件）,反相HPLC分离的总体方案设计,1、确定样品是属于
10、常规的还是特殊的 特殊样品包括： 无机离子 对映体 生物分子 合成的高分子 碳水化合物 异构体,2、选择分离条件，进行第一次分离,选择流动相 在反相色谱中常用水/乙腈 pH的选择思路 选低pH可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性 低pH与常见酸碱官能团的pKa值相差较远，组分在此条件下的tR受pH变化影响小 初期应避免使用三乙胺和离子对试剂等添加剂,准备标准样品 过滤样品 安装色谱柱 冲洗柱，平衡 平衡检测器 进样 分析结果,选择逐步方法开发步骤 用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降低洗脱液强度 尝试运行梯度,无峰/响应,分离度差的峰,第一次运行得到的结果可能:,检测方法不正确 浓度太稀,
11、提高进样浓度，或者在无色 谱柱的条件下注射少量样品,改变流动相,优化系统,得到了色谱峰 - 是 - 否,检查 HPLC系统,3、做初次运行并根据谱图将样品分类 0.5k20 等度洗脱可行，超出此范围,等度洗脱可行的样品,建议用梯度洗脱的样品,反相保留太弱的样品 改变pH、加入离子对试剂、改变柱子、改用正相色谱,强保留样品 用非水反相或正相条件,复杂样品,4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳B% 5、评价第二次运行中峰的质量-柱效、峰宽、峰形 峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、pH、添加剂等） 运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间,6、 对等度方法，
12、可以改变ACN%来改善峰间距和分离度 若有必要， ACN改为MeOH，并根据峰间距和分离度优化MeOH% 可以进一步混合ACN和MeOH成为三元溶剂系统，并优化 7、若6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件,8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度 结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型 分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件 9、对梯度方法，改变初始和最后的B%、梯度变化速度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间 10、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间,等度分离方法,反相色谱的方法开发,
13、开发过程实例 色谱条件 色谱柱：C18，4.6mm15cm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 （或走梯度） 流速：1ml/min 样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben),改变容量因子 K,(改变比例), 对羟基苯甲酸甲酯 对羟基苯甲酸丙酯 对羟基苯甲酸丁酯,通过改变流动相比例改变选择性,改变选择性,通过改变流动相组成改变选择性 同样强度的不同溶剂,固定相优化：改变色谱柱,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,1,2,4,5,6,7
14、,8,9,10,3,C-18,C-8,10种巴比妥药物的分离（等梯度）,优化流动相 - 困难的分离,1.从甲醇/水开始，优化溶剂组成以使所有色谱峰在合理的 k 范围流出. 2.选择洗脱强度相等的乙腈/水混合流动相进行下一次分析. 3.用四氢呋喃/水流动相重复分析4.按比例混合等强度流动相再进行进样分析,三种流动相的比较,洗脱顺序,选择性,离子型化合物的分离方式,使用离子交换柱离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 加入“对离子”，使样品呈中性,离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 降低
15、流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8内,如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子交换色谱 使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法”,分离弱离子化化合物的初始实验条件,水相缓冲液 /乙腈 可变 (k = 0.520),分离变量,初始选择,尺寸 粒度 键合相,15 (或 25) x 0.46 cm 5 或 3.5 m C18 或 C8,溶剂 A 和 B（% B）,温度,体积 质量,40C,20 L 25 g,色谱柱,流动相,样品量,流速,1 - 2 mL / min,添加剂,需要时，25 - 50 Mm 三乙胺,缓冲液,25 mM 磷酸钾, pH 3,缓冲液,缓冲液 pKa缓冲范围 缓冲液 pKa 缓冲范围 磷酸 甲酸 3.8 2.84.8 pK1 2.1 1.13.1 乙酸 4.8 3.85.8 pK2 7.2 6.28.2 Tris(三羟甲基氨基甲烷) pK3 12.3 11.313.3 8.3 7.39.3 柠檬酸 硼酸 9.2 8.29.3 pk1 3.1 2.14.1 吡咯 10.5 9.511.5 pK2 4.7 3.75.7 氨 9.2 8.21
