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1、包涵体的纯化和复性总结包涵体的纯化和复性总结 二、包涵体的洗涤 1、包涵体的洗涤问题 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用 6M 盐酸胍溶解 充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到 4M,离心把沉淀和上 清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的 办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶 解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白 弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，
2、溶解也需要长点时间，也需要大量的溶 剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。 2、如何得到比较纯的包涵体 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、 质粒和其 它杂质。洗涤常用 1%以下的中性去垢剂，如 Tween、Triton、Lubel 和 NP40 等加 EDTA 和还原剂 2-巯基苏糖醇（DTT）、-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶 液离子强度升高而加强， 在洗涤包涵体时可加 50 mM NaCL。 这样提取的包涵体纯度至少 可达 50%以上， 而且可保持元结构。 也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性
3、去垢剂/EDTA/还 原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液 pH 以与工程菌生理条件相 近为宜，使用的还原剂为 0.1-5mM。EDTA 为 0.1-0.3 mM。去垢剂如 Triton X-100、脱 氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外 膜蛋白 Omp T(37 KDa)在 4-8mol/L 尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性 过程中可导致重组蛋白质的降解。 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆 性变性作用，所需浓度尿素 8-10M，盐酸胍 6-8M。尿素溶
4、解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶 解度为 70-90%， 尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐， 对重组蛋白质的 氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不 会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点， 故目前已被广 泛采用。 盐酸胍溶解能力达 95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有 成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离 子交换色谱有干扰等缺点。 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯 合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步
5、就能达到纯度为 95%以上的包 涵体。 8M 高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液， 放在 4 度冰箱过夜后出现沉淀， 这种现 象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验 三、关于包涵体的溶解： 1、 请教 GST 包涵体溶解 2、包涵体的溶解 十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换， 调 pH 不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH 不同，前者钠盐便于保存罢了 3、有关包涵体的溶解问题 强的变性剂如尿素（6-8M） 、盐酸胍（GdnHCl 6M） ，是通过离子间的相互作用，打断包 涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键
6、，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素， 因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的 异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性 pH 值下长期保温时。SDS、 正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl 等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶 解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一 些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏 糖醇（DTT） 、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶， 有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶
7、解。 4、8M 尿素溶解的包涵体溶液应如何保存? 我在 4 度放了半个月，目前没出什么问题 5、8M 尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题? BI 溶液在室温放置 48 小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一 些氨基酸酰基化，因而早些处理 BI 溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。 做完裂解之后加 TritonX100 轻摇min，蛋白溶解的会多些四、包涵体的复性 1、包涵体如何复性 包涵体的复性主要有两种方式： 1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释 2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂 其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上
8、的 2 硫键，很 可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确 包涵体的复性还要注意以下几点： 1.首先要获得较高纯度的包涵体。 2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不 要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。 3.透析前后均要离心 4.透析不能太快. 5.纯化的最佳条件要摸索。 小技巧： 1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量 Triton-X100. 2) 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性 3） 复 性 液 的 组 成 很 有 讲 究 ， 本 人 使 用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还 加入一定
9、的 L-Arginine-Hydrochloride 12-24h 4) 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析 12- 24h 5) 复性率的测定 据变性蛋白和非变性蛋白的光学性 质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解） 6）TritionX100、SDS 这一类去垢剂最后不易去除， 在制药行业中一般不允许采用。好像 SDS 最后残留量 不能大于 0.5%吧，忘了。 我用 Triton 洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培 养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下 3-4 条杂带，这样后续的纯化就 很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难 optimize
10、。 这段文字可以参考： 用 Novagen 公司pET System Manual提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波 裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。 渗透休克 用 1.2.3 方法诱导细菌（10ml 体积） ，测菌液 OD600，10000 r/min 离心 0.5 min 去上清，加入渗透休克溶液 1（V1= OD 600V2/5，V1 为渗透休克溶液 1，V2 为培养新 鲜菌液） ，冰浴 10 min，10000 r/min 离心 0.5 min，去上清。加 V1 体积渗透休克溶液 2 重悬，摇动冰浴 10 min，10000 r/min 离心 0.5 min
11、，保存上清、细菌沉淀。作如下处理 ： 上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加 1/10 体积 100% TCA (w/v)，涡漩 15 sec.，冰浴 10 min，13000 r/min 离心 5 min，100 ul 丙酮洗涤沉淀，干燥 1 h，加 V1/2 体积 1 PBS（pH 10） 溶解， -20保存， 取 10 ul 加入等体积 2SB， 进行 12% SDS-PAGE 电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系统照相。 超声波裂解细菌 渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20 mM Tris-HCl（pH 7.5， 0
12、） 重悬， 冰浴， 超声波裂解， 20%工作选择， 脉冲粉碎 1 min， 然后 13000 r/min 离心 5 min， -20保 存上清、 细菌沉淀。 上清进行 TCA 沉淀， 处理同上。 沉淀用 Protein Extraction Reagent（Ni- NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供 ）按 Novagen 公司pET System Manual 提供方法反复处理， 洗涤包涵体。 包涵体按培养菌 100OD600/3 ul 体积加 1% SDS 溶解， 加等体积 2SB，进行 12% SDS-PAGE 电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描
13、，计算融合蛋 白 Trx-PrPC27-30 占细菌总蛋白的相对含量。 1.2.7 重组融合蛋白的纯化 PrP-pET-32a（+） 转化表达菌 E.coli BL21（DE3） ， TB 培养基中， 25， AMP 200 ug/ml， 摇床（250 rmin）培养至 OD600 约为 1.5，更换等体积新鲜 TB 培养基，加入 IPTG 至 终 浓 度 1 mM， AMP 200 ug/ml， 25 ， 4 h， 4000 g 离 心 收 集 菌 体 。 按 Ni- NTA HiBind Purification Kit 使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。 或使用笔者改进方法， 将Ni-N
14、TA HiBind Purification Kit使用说明中Buffer D改成Wash- Buffer， Buffer-E 改成 Elute-Buffer， 最后用 Buffer-E 重生 Ni-NTA HiBind Rasin， Binding- Buffer 平衡以后加 50%酒精保存，以免长菌。 洗脱所得蛋白用 TCA 沉淀，处理同上，得融合蛋白 Trx-PrPC27-30，冻干保存。然后 12% SDS-PAGE 凝胶电泳分析。 3、包涵体复性 2 精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。 另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。 对于疏水
15、蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度（可以试试 4 度诱导过夜）和 IPTG 的量， 降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。或者换成 GST 融合表达载体，GST 可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我的蛋白包涵体在经变 性纯化后透析复性过程中， 在透析液中加入了 1%的甘氨酸和 5%的甘油， 有一定的助溶 效果。我想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成 正确的二硫键。复性是一个很难捉摸的过程，不同蛋白的复性条件也各不相同。 5、包涵体复性问题 包含体复性三大原则： 1。低浓度 2。平缓梯度 3。低温 有蛋白析出最大的可能型是：蛋白浓度太高，
16、建议你稀释以后再作透析。 此外，透析的盐浓度（比如 ura）要平缓降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。 6、包涵体复性形成聚集物 关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节 PH 可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白 有没有活性还是问题，虽然样品溶解了，但活性不高或没有也不行呀！ 7、复性中蛋白析出！ 出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和 PH 值逐渐变化 的方法，例如根据你包含体的溶液成分，每隔 1 个 PH 或浓度值配置一种溶液，逐步透 析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的 比率应该很低。 若加变性剂尿素可加到 2M，盐酸胍可加到 1-1.5M； 另外可将甘油浓度增加，范围可在30%，且在复性样品中也可加适量甘油；一些拙见。 8、包涵体复性液配方 对于包涵体复性，一般在尿素浓度 4M 左右时复性过程开始，到 2M 左右时结束。对于 盐酸胍而言，可以从 4M 开始，到 1.5M 时复性过程已经结束。TRIS 系统和 PBS 系统都 没有明确
