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1、,课题3,分解纤维素的微生物的分离,（一）纤维素与纤维素酶,1、纤维素： 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质。广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，,2、纤维素酶：,一、基础知识,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即CX酶、 C1酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,3、纤维素的分解,能分解纤维素的微生物有各种细菌、真菌和少数放线菌。,纤维素,纤维二糖,葡萄糖,草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？,在草食性动物等的消化道内，共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有
2、分解纤维素的能力。,甲 乙,在2支20mL的试管中，分别放入16cm的滤纸条，再分别加入pH为4.8、物质的量浓度为0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液10mL、11mL。在加入10mL缓冲液的试管中加入1mL纤维素酶（7080U/mL）。将二支试管固定在50mL的锥形瓶中，在摇床上以140r/min的转速振荡反应1h，观察结果。,4、纤维素酶活性的测定实验：,纤维素酶活性的测定实验：,滤纸崩溃法,练一练：,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种 B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成
3、葡萄糖,2、下列生物能分解纤维素的是（ ） 人 兔 牛 蘑菇 纤维杆菌,A. B.,C. D.,C,.纤维素分解细菌的筛选：,1.方法：,刚果红染色法这种方法能够通过颜色 反应直接对微生物进行筛选,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,2.原理：,讨论：,1.纤维素酶的种类及怎样分解纤维素？ 2.刚果红怎样选择纤维素分解菌的作用？ 3.旁栏思考题 4.选择培养中思考题,利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是,A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红
4、能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物 D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,练一练：,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,二、实验设计,（此步可以省略）,提示：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。 本课题先通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。,旁栏思考题本实验的流程与课题2中的 实验流程有哪些异同？,纤维素分解菌大多分布在_ _的环境中。采集土样时，应选择富含纤维素的环境。如树林中多年落
5、叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。也可将滤纸埋在土壤中一个月左右，这样会有能分解纤维素的微生物生长。,【资料一】土壤取样,富含纤维素,旁栏思考题为什么要在富含纤维素的环境中找纤维素分解菌？,根据生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,旁栏思考题将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？,人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,（此步可以省略）,增加纤维素分解菌
6、的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,1、目的：,【资料二】选择培养,（富集培养）,根据样品中目的菌株数量来确定是否需要,参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题,a、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂。,b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的 微生物可以大量繁殖。,c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,以不含纤维素的培养基作为对照，如用牛肉膏蛋白胨培 养基与之对照,操作提示,选择培养的操作方法,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形
7、瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1-2d，直至培养液变混浊。 吸取一定量的培养液，转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变混浊。,旁栏思考题为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,（此步可以省略）,梯度稀释,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到106,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样
8、品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,（此步可以省略）,鉴别纤维素分解菌的培养基配方,(水溶性羧甲基纤维素钠),将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,1. 制备鉴别培养基:参照旁栏中的比例 2. 涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30倒置培养,【资料三】刚果红染色法,常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。,刚果红染色法,方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,方法二：在倒平板时就加入刚果红,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选
9、产生透明圈的菌落,（此步可以省略）,挑选产生透明圈的菌落,参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落,课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落： 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物 （二）分离的结果是否一致： 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_ 发酵和_ 发酵。纤维素酶
10、测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。,课题延伸,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,D,1、下列材料中纤维素含量最高的是 ( ) A杨树 B小麦 C玉米 D棉花,C,2、纤维素酶能够分解 ( ) A纤维素的微生物 B淀粉的微生物 C纤维素 D淀粉,B,3、刚果红能与哪项物质形成红色复合物 ( ) A纤维二糖 B纤维素 C葡萄糖 D麦芽糖,B,4、寻找纤维素分解菌应到( ) A湿润的环境中 B富含纤维素的环境中 C富含无机盐的环境中 D池塘中,D,5、纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有 ( ) ANaNO3 BKCl C酵母膏 D纤维素粉,D,6、选
11、择培养时应将锥形瓶固定在 ( ) A桌子上 B温箱里 C窗台上 D摇床上,B,7、选择培养的结果：培养液变 ( ) A清澈 B浑浊 C红色 D产生透明圈,C,8、刚果红染色时，加入刚果红可在 ( ) 制备培养基时 梯度稀释时 倒平板时 涂布时 培养基上长出菌落时 A B C D,A,9、两种刚果红染色法的结果是 ( ) A均会出现透明圈 B均不会出现透明圈 C方法一出现，方法二不出现 D方法一不出现，方法二出现,再见,讨论：,1.纤维素酶的种类及怎样分解纤维素？ 2.刚果红怎样选择纤维素分解菌的作用？ 3.旁栏思考题 4.选择培养中思考题,纤维素的分解,能分解纤维素的微生物有各种细菌、真菌和少
12、数放线菌。,纤维素,纤维二糖,葡萄糖,讨论：,1.纤维素酶的种类及怎样分解纤维素？ 2.刚果红怎样选择纤维素分解菌的作用？ 3.旁栏思考题 4.选择培养中思考题,讨论：,1.纤维素酶的种类及怎样分解纤维素？ 2.刚果红怎样选择纤维素分解菌的作用？ 3.旁栏思考题 4.选择培养中思考题,提示：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。 本课题先通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。,旁栏思考题本实验的流程与课题2中的 实验流程有哪些异同？,旁栏思考题为什么要在富含纤维素的环境中找纤维素分解菌？,根据生物
13、与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,旁栏思考题将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？,人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。,参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题,a、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂。,b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的 微生物可以大量繁殖。,c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的
14、作用,以不含纤维素的培养基作为对照，如用牛肉膏蛋白胨培 养基与之对照,旁栏思考题为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便，不存在菌落混杂问题,产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,思考：这两种方法各有哪些优点与不足,选择培养,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),旁栏思考题这两种方法各有哪些优点 与不足？,颜色反
15、应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐 刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便，不存在菌落混杂问题,产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,思考：这两种方法各有哪些优点与不足,方法一缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 方法二优点是操作简便，不存在菌落混杂问题 缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可以使能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应；缺点二有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红，形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分,配培养基,提示：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。 本课题先通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。,旁栏思考题本实验的流程与课题2中的 实验流程有哪些异同？,
