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1、第四章 分子克隆,一、 分子克隆与基因工程 （一）、分子克隆(molecular cloning)是指按照人的意愿, 在体外将制备的DNA片段与载体重组, 然后导入受体细胞, 并在受体细胞中复制、 扩增, 以获得该DNA分子的大量拷贝。此技术称为分子克隆技术或DNA重组技术. （二）、基因工程(genetic engineering)是指将基因进行克隆, 并利用克隆的基因表达,制备特定的蛋白质或多肽产物, 或定向改造细胞和个体的特性所用的方法及相关工作。它包括上游技术(分子克隆)和下游技术(基因表达)。,第一节 工具酶 一、 分子克隆的主要因素：工具酶、载体和受体细胞。 二 、工具酶的定义 工
2、具酶(tool enzyme)是在DNA的切割 、合成、 剪切 补平、 连接和修饰等过程中起重要作用的酶类。常用的主要有:限制性核酸内切酶、 DNA聚合酶I、 反转录酶、 DNA连接酶 、碱性磷酸酶、 多核苷酸激酶和末端脱氧核苷酰转移酶等。,三 、限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease) （一）、定义：是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶. （二）、分类：根据限制酶的结构与作用特点不同,可将它们分为I、 II和III。其中II能识别双链DNA特定核苷酸序列,并在此序列内有特异的切割位点产生特异的DNA片段。有黏性末端(sticky end)和平末
3、端(blunt end)两类切口。可有同工异源酶和同尾酶。 （三）、主要用途: 1、在分子克隆中切割DNA以获取目的基因片段，切割载体形成切口，使目的基因能插入载体; 2、分析限制性片段长度多态性（RFLP），用于遗传病的诊断，法医DNA指纹图谱分析等; 3、构建DNA物理图谱、基因定位及DNA同源性分析等。,四、DNA聚合酶(polymerase) （一）、DNA聚合酶I和Klenow片段： DNA聚合酶I是单一肽链的多功能酶，且具有3种酶的活性。 Klenow片段是指用特异的蛋白酶水解DNA聚合酶I生成的大片段。 （二）、Taq DNA聚合酶(Taq酶)是一种耐热的DNA聚合酶。最佳作用温
4、度是70-80，可用于DNA测序和PCR反应。 （三）、逆转录酶(reverse transcriptase)是依赖RNA的DNA聚合酶，以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA的酶类。,（四）、DNA连接酶(DNA ligase)是指能催化两个互补黏性末端或平末端双链DNA分子的5磷酸基团与3 羟基形成磷酸二酯键，实现DNA的体外重组的酶类。 （五）、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团的酶类。 （六）、末端脱氧核苷酰转移酶(TDT) 、T4多核苷酸激酶与核酸酶S1,第二节 载体 一、 载体(vector)的定义：
5、是指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具,其本质为DNA。常用的载体有质粒、噬菌体、黏粒、酵母质粒和病毒等。,图4-1 pBR322质粒物理图谱,图4-2 pUC18/pUC19质粒物理图谱,图4-3 重组杆状病毒的构建和筛选,二、载体的分类：克隆载体和表达载体。 （一）、定义：所谓克隆载体是指能将外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体；表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效表达和正确翻译的载体。在常用的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列）即成表达载体，它不仅可以携带外源基因片段进入宿主细胞，而且可以在宿主细胞中表达外源基因. （二）、载体具备
6、的特征：能自我复制并具有较高的拷贝数,有适宜的分子量,一般应10KB; 带有遗传筛选标记; 有适当的限制酶切位点,便于外源基因的插入与筛选.,图4-5 YAC克隆示意图,(三)、类别： 1、克隆载体有质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、酵母细胞中克隆基因常用的载体（YAC）和动物细胞基因克隆的载体（猿猴空泡病毒40载体SV40、腺病毒载体和逆转录病毒载体）。 2、表达载体有原核细胞表达载体（启动子-核糖体结合位点-克隆位点-终止子）、哺乳动物细胞表达载体（启动子/增强子-克隆位点-终止位点和加polyA信号）和穿梭载体(在原核和真核细胞分子克隆中均能应用的载体）。 3、报告基因（reporter
7、gene): 是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因。如需检测某一顺式调控序列的启动子活性，可通过基因重组方法将待测DNA序列与一个特异报告基因连接并导入受体细胞进行表达，然后通过检测报告基因产物的量来推测待测DNA序列是否具有启动子活性。目前比较理想的报告基因有氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因和B-半乳糖苷酶基因等。,图4-6 增强子作用机制,图4-7 乳糖操纵子的操纵基因和CAP-cAMP结合位点序列,图4-8 半乳糖操纵子的结构及其调控机制,第三节 分子克隆的基本步骤 一、目的基因的获取（分） （一）、被研究的某一基因或DNA序列称为目的基因或靶基因。 （二）
8、目的基因制备方法有从基因文库中获取、逆转录合成、人工合成和直接从染色体DNA中分离。 二、载体的选择（切） 三、目的基因与载体连接（接）： 黏性末端DNA分子的连接和平末端连接。 四、重组DNA导入受体细胞（转）：转化(transformation)、转染(transfection)和感受态细胞（competent cell)的概念。 五、重组体的筛选（筛）,图4-9 DNA克隆的过程,图4-10 外源基因在噬菌体载体中的克隆,第五章 DNA测序技术,第一节 DNA测序的意义及策略 一、 DNA测序的定义：测定并分析核酸的序列就叫DNA测序，是研究其结构、功能及其关系的前提，是分子生物学最基本
9、的课题，并为临床疾病的分子诊断提供最为精确的判断依据。 二、 DNA测序策略：因待测DNA分子的性质、测序方法和目的不同而异。 （一）、确证性测序策略 多数情况下, 测序是对已知序列进行鉴定和证实,即确证性测序(confirmatory sequencing). 如病原微生物保守序列分析、次级克隆DNA的插入方向、定点突变的检测等。 （二）、未知序列的从头测序策略 未知DNA序列的分析是指确定一个未知序列的准确长度及核苷酸排列顺序，称为从头测序（de novo sequencing).,1、小片段（ 500bp ）测序，可以直接利用M13mp或质粒系统克隆、测序。 2、大片段或全基因组测序，可
10、有下列方法： 1）、随机测序法： 鸟枪法（shotgun）与人工转座子法。 2）、定向测序法：是指从靶DNA的某一端开始测序，直到将靶DNA的序列全部测定。 3）、全基因组测序策略大体可分两种，一种是先作图后测序；一种是先测序后定位。 三、最经典的两者DNA测序技术：链末端终止法和化学降解法。,第二节 链末端终止法 一、测序原理：Sanger等于1977年在加减法测序的基础上发明了双脱氧链末端终止法。其原理是利用DNA聚合酶，以单链DNA为模版，以dNTP(含标记的dNTP）为底物，在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序
11、引物引导下，合成四组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA的序列。 二、测序体系 （一）、待测模板、测序引物和DNA聚合酶 （二）、dNTP的放射性核素标记 （三）、DNA片段的凝胶电泳。 三、特点：一次可测500个以上的碱基序列，便于实现自动化。,图5-1 末端终止法测定DNA序列,第三节 化学降解法 一、测序原理：首先对待测DNA作末端放射性标记，标记后的识读DNA分成4组或5组，分别用不同的化学试剂对不同的碱基进行特异性的化学切割，通过控制化学反应条件，使碱基的断裂只随机发生在某一个特定的位点，由此各组均产生不同长度的D
12、NA片段，通过高分辨率的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA的序列。 二、测序体系 （一）、待测DNA：对标记的待测DNA的纯度要求较高。 （二）、待测DNA的末端标记和碱基特异的化学切割 （三）、电泳图谱的 三、特点：一次可测600个碱基序列，应用不如链末端终止法。,图5-2 化学降解法测定核酸序列的原理,第四节 自动化测序 一、最通用和有效的序列分析方法：自动化链末端终止法测序取代手工测序已成为目前DNA序列分析的主流。因为有下列突破： （一）、全自动化操作系统代替手工操作； （二）、荧光燃料标记代替放射性核素标记； （三）、PCR循环测序反应代替酶反应； （四）、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳； （五）、高速自动化的分析系统代替人工识读。 二、分类 （一）、基于单一荧光燃料标记的自动化测序系统 （二）、基于多种荧光燃料标记的自动化测序系统,图5-3 自动化末端终止法DNA序列测定的原理,思考题 1、何为分子克隆、基因工程、限制性核酸内切酶、克隆载体和表达载体？ 2、简述分子克隆的基本步骤。 3、简述DNA测序的定义及其经典方法。,参考文献 1.吕建新,尹一兵主编. 分子诊断学. 中国医药科技出版社.2004.6 2.杨荣武主编.分子生物学. 南京大学出版社.2007.1,谢谢！,
