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1、疫苗基本知识,1,在发展中国家，死亡总人数的30%50%死于传染病。 在发达国家，传染病死亡人数仅占死亡总人数的4%8%，主要得益于疫苗的广泛应用。,一、概述二、灭活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗,微生物疫苗,一、概述,1、疫苗的概念,人工免疫：有计划、有目的地给人体接种抗原，或输入抗体或免疫细胞，使机体获得某种特异性抵抗力，从而达到预防或治疗某种疾病的目的。,一、概述,人工主动免疫 人工被动免疫 输入物质 抗原（疫苗） 抗体或致敏淋巴细胞 诱导时间 慢（14周） 快（立刻发挥作用） 维持时间 长（数月数年） 短（23周） 用 途 主要
2、用于预防 治疗或应急预防,人工主动免疫和人工被动免疫的比较,疫苗：用于人工主动免疫的生物制品。,一、概述,疫苗：刺激机体免疫系统对某种病原微生物处于高度戒备状态-“时刻准备着！”,一、概述,人类急需的疫苗：HIV、HCV 生物武器和生物恐怖：炭疽杆菌、鼠疫杆菌、天花病毒,一、概述,2、理想疫苗的标准, 安全：无致病性和接种后异常反应 有效：可诱导产生可靠的保护性免疫 实用：易于接种、保存和运输，价廉,3、疫苗的发展历史,古典疫苗时期：牛痘苗、狂犬病疫苗 培养疫苗时期：脊髓灰质炎疫苗、卡介苗 基因工程疫苗时期：乙型肝炎基因工程疫苗,一、概述,一、概述二、灭活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗五、活
3、载体疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗,微生物疫苗,灭活疫苗（inactivated vaccine）：又称死疫苗，是用化学或物理的方法，将具有感染性的完整的病原微生物杀死，使其失去传染性而保留抗原性而成。,二、灭活疫苗,百日咳、乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、狂犬病、伤寒、钩体病、甲型肝炎、鼠疫、流感、脊髓灰质炎（salk）等疫苗。,二、灭活疫苗, 缺点：免疫力维持时间短，需要多次重复接种；主要诱发体液免疫，不能产生细胞免疫或黏膜免疫应答；接种剂量较大，不良反应；需要严格灭活。,二、灭活疫苗, 优点：易于制备；免疫原性稳定性高；储存及运输方便；易于制备多价疫苗；疫苗安全性高。,SAR
4、S疫苗研究 1、国内全病毒灭活疫苗所用的SARS毒株均为原始毒力很强的毒株，其研发、检定和将来的生产都必须需在P3级条件下进行，不能适应规模化生产。,二、灭活疫苗,2、尚无有效的动物模型，SARS流行爆发具有不确定性，各种疫苗的安全性和有效性的临床前验证较困难。,一、概述二、灭活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗,微生物疫苗,三、减毒活疫苗,减毒活疫苗（live-attenuated vaccine）：用人工诱变或从自然界筛选出的毒力高度降低或无毒的活的病原微生物制成的疫苗。可模拟自然发生隐性感染，诱发理想的免疫应答而又不产生临床症状。,结
5、核病、脊髓灰质炎（Sabin）、麻疹、乙型脑炎、甲型肝炎、风疹疫苗、腮腺炎等疫苗。,三、减毒活疫苗, 优点：能诱发全面、稳定、持久的体液、细胞和粘膜免疫应答；一般只须接种一次；可采用口服、喷鼻或气雾途径免疫。 缺点：有效期短和热稳定性差，运输、保存条件要求较高；回复突变危险；使用范围相对窄。,三、减毒活疫苗,基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine）：采用分子生物学技术，去除与毒力或毒力相关基因片段，使病原微生物毒力减低或丧失。用缺失突变毒株制成的疫苗。,三、减毒活疫苗,与自然突变株（多为点突变毒株）相比，基因缺失活疫苗具有突变性状明确、稳定、不易发生毒力返祖的优点。
6、,一、概述二、灭活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗,微生物疫苗,对于某些抗原性弱、易发生免疫逃避的病原体，常规疫苗往往难以获得有效的免疫应答及保护性。,四、亚单位疫苗,一些免疫保护机制不清，可能诱导免疫病理反应，有潜在致肿瘤作用的病毒，以及不易培养的病原体，则难以用传统方法生产疫苗。,亚单位疫苗（subunit vaccine）：不含病原体核酸，选用能诱发宿主产生中和抗体的微生物蛋白或表面抗原而制成的疫苗。,四、亚单位疫苗, 白喉类毒素、破伤风类毒素 流感嗜血杆菌荚膜多糖、脑膜炎球菌荚膜多糖 流感病毒血凝素和神经氨酸酶 乙型肝炎HBsAg
7、（基因工程疫苗） 人乳头瘤病毒,四、亚单位疫苗,优点：除去了病原体中与诱发保护性免疫无关或有害成分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明显增强而稳定，可靠性提高，对机体引起的不良反应小。 缺点：需要选用佐剂；不能诱发细胞免疫和黏膜免疫。,四、亚单位疫苗,将病原体中能诱导保护性免疫应答的目的抗原编码基因克隆后，插入适当的原核或真核表达载体质粒； 再将重组质粒导入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中高效表达目的基因； 分离、提取、纯化目的蛋白而制成。,基因重组亚单位疫苗 (genetic engineering subunit vaccine),四、亚单位疫苗,下一步工作计划,基因工程疫苗发展的重点 不
8、能或难以培养的病原体； 有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体； 传统疫苗效果差或不良反应大的病原体； 能简化免疫程序、降低成本的多价疫苗。,四、亚单位疫苗,一、概述二、灭活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗,微生物疫苗,活载体疫苗（live vector vaccine）：又称重组载体疫苗（recombinant vector vaccine），是将有效的目的抗原的编码基因导入活载体（无或弱毒的细菌或病毒株）中，构建重组菌株；目的基因可随重组菌株在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护作用。,五、活载体疫苗,载体：腺病毒、牛痘病毒、
9、金丝雀痘病毒、伤寒沙门菌减毒株、卡介苗、乳杆菌等。 病原体：乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾杆菌等。,五、活载体疫苗,一、概述二、灭活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗,微生物疫苗,1990年，Wolff等首次发现，给小鼠肌肉注射裸露质粒DNA后，质粒携带的基因可被肌细胞摄取并在其中表达，还可诱生特异性免疫应答。,四、核酸疫苗,核酸疫苗（nucleotide vaccine）：又称DNA疫苗（DNA vaccine），是将一种或多种目的抗原的编码基因克隆到真核质粒表达载体上；再将重组质粒直接注入到体内，在宿主细胞内表达目的蛋白，诱发特异性免疫
10、应答。,四、核酸疫苗,目前进入临床试验的核酸疫苗有HIV DNA疫苗和疟疾 DNA疫苗。,四、核酸疫苗,由于核酸疫苗具有构建容易、生产方便、表达稳定及可诱发全面的免疫应答等特点，在抗感染、抗肿瘤免疫及疾病的预防等方面具有广阔的应用前景，被誉为疫苗的“第三次革命”。,四、核酸疫苗,局部注射的核酸（重组质粒DNA）被周围的细胞（如黏膜上皮细胞、抗原提呈细胞）摄取后，进入核内进行转录，并在胞质中翻译成目的蛋白。,1、免疫机制,四、核酸疫苗,目的蛋白被蛋白酶复合体降解成含有表位的抗原肽，可作为： “内源性抗原”：与MHC类分子结合，诱发CTL介导的细胞免疫应答。 “外源性抗原”：与MHC类分子结合，诱
11、发偏向Th1型免疫应答。,四、核酸疫苗,目的蛋白亦可通过细胞分泌或细胞破裂的方式进入组织间，以天然折叠形式激活B淋巴细胞而产生抗体。,四、核酸疫苗,DNA疫苗接种后，体内仅表达pgng水平的外源蛋白，但能诱发强而持久的细胞免疫和体液免疫应答。 如何解释这一现象呢？,四、核酸疫苗,目的基因（含载体质粒）含有CpG基序的回文序列，能激活较强的CTL效应，并能激活巨噬细胞与NK细胞，因此，CpG回文序列被称为免疫刺激DNA序列。,CpG基序与IL-2、TNF-、IFN-的基因结构相似而产生协同作用。,四、核酸疫苗,2、构建与免疫,目的基因的选择：侧重于免疫原性，即所表达的目的蛋白刺激机体免疫应答的能
12、力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T细胞抗原表位，是保证核酸免疫有效的先决条件。,四、核酸疫苗,核酸疫苗所选择的目的基因应尽量避免有害基因成分，特别是病毒或肿瘤的核酸免疫。,四、核酸疫苗,载体的选择：构建DNA疫苗的质粒通常是非复制型的真核表达质粒，能高水平地表达目的基因。,四、核酸疫苗,重组质粒可分为两个部分： 转录部分：由启动子、插入的目的抗原cDNA和poly A终止子组成，指导目的蛋白在体内表达，诱发特异性免疫应答。 佐剂部分：CpG基序。,四、核酸疫苗,启动子的选择：质粒在宿主细胞内表达外源性蛋白的水平与调控DNA表达的启动子关系密切。表达水平的不同又直接影响免疫应答的强度和持
13、续性。,四、核酸疫苗,DNA疫苗的优化 联合构建：在载体质粒中插入2个或2个以上目的抗原基因，既能激活CD8T细胞产生特异性CTL，又能激活CD4Th2细胞产生体液免疫。 协同构建：将目的基因与某种细胞因子的基因构建成嵌合基因，以促进目的基因的免疫效果。,四、核酸疫苗,免疫途径、剂量、时间：常见免疫途径有肌肉注射、皮内或皮下免疫、粘膜免疫等。,四、核酸疫苗,3、核酸疫苗与传统疫苗的比较,传统免疫所使用的抗原一般是灭活病原体、减毒的活病原体或病原体的亚单位蛋白。 核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段，可提供与天然构象极为接近的目的蛋白，提呈给宿主免疫系统，与自然感染过程相似。,四、核酸疫苗,核
14、酸疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效力。,四、核酸疫苗,灭活疫苗和亚单位疫苗在体内代谢较快，难以长时间维持较稳定的含量，需多次接种免疫原，加强免疫。,核酸疫苗可在体内不断翻译表达，较长时间维持较高的蛋白水平，免疫具有连续性，一次接种可获得长期或终身免疫力。,四、核酸疫苗,采用不同毒株之间的保守DNA序列作核酸疫苗，可使其免疫作用突破地理株的限制，从而有效地预防病原体极易发生变异的某些疾病（如丙型肝炎、甲型流感、艾滋病等）。,四、核酸疫苗,核酸疫苗与世界卫生组织儿童计划免疫长远目标（用一种疫苗预防多种疾病）相吻合，不仅能预防疾病，还可作为治疗性疫苗，治疗一些复杂难
15、治的疾病，如病毒性肝炎、癌症等。,四、核酸疫苗,一、概述二、灭活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗,微生物疫苗,植物疫苗（plant-based vaccine）：亦称转基因植物疫苗（transgenic plant vaccine），是指将抗原基因导入植物细胞并在其中表达，人食用已表达目的抗原的转基因植物后，可诱发特异性免疫应答的新型疫苗。,五、植物疫苗,（1）建立整合抗原基因的稳定表达植株，并可通过无性或有性繁殖生产大量的转基因植物。,1、植物疫苗的构建,五、植物疫苗,（2）建立瞬时表达植株，即利用基因工程植物病毒为载体，将抗原编码基因
16、插入到植物病毒基因中，再将重组病毒株感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制而得以高效表达，获得高产量的目的蛋白。,五、植物疫苗,（1）植物种子、块茎、果实等是蛋白质很好的聚积和保存场所，使植物疫苗（重组蛋白）的生产、运输和储存更为容易，免疫途径更简便、安全。,2、植物疫苗的优点,五、植物疫苗,（2）植物疫苗（抗原）通过胃内酸性环境时，可受到细胞壁的保护，直接到达肠粘膜部位，诱发粘膜和全身免疫应答，比传统的免疫途径更有效。,五、植物疫苗,（3）植物疫苗不需严格的分离纯化程序，经济价廉，可望替代传统的发酵生产，有利于在发展中国家推广。,五、植物疫苗,一、概述二、灭活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗,微生物疫苗,预防性疫苗的接种对象是健康人群，多采用模拟自然感染过程的策略，一般为微生物的保护性抗原，成分较单纯，主要用于
