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1、液相色谱和毛细管电泳中的衍生试剂,为什么衍生 衍生方式 衍生试剂的构成与要求 衍生试剂 种类及应用,液相色谱和毛细管电泳中的衍生试剂,为什么衍生,检测方法与检测信号 化学衍生主要是用于改善检测灵敏度 不好线性检测或较窄线性范围检测和高检出限的分析物，通过衍生得到改善 不能与其它基体物质分辨的分析物，通过衍生可以扩大差别 荧光生成（fluorogenic）试剂和荧光标记（fluorescent label）试剂.,衍生反应方式,柱前衍生（pre-column derivatizations） 柱后衍生（post- column derivatizations) 柱中衍生 （on column d
2、erivatizations) 离线（off line)柱前衍生 在线（on line)柱前衍生， 离线（off line)柱后衍生 在线柱后衍生,柱前衍生,自由性大 衍生与柱分离的流动相无关 提高检测灵敏度 改善分离方法选择性和色谱分辨率 易于优化反应条件 衍生物稳定 产率高 副反应产物少 选择易与色谱流动相混合的溶剂作为衍生溶剂,在线柱后衍生,柱后反应器 衍生反应不强调生成单一的稳定的衍生产物 过量的衍生试剂干扰检测 要求快速并允许现时检测 加泵供给衍生试剂 反应溶剂必须与分离用的流动相易混溶 衍生试剂与柱淋洗液有效混合,柱中衍生,这一衍生方法基本是把衍生试剂溶入流动相，注射样品后，在柱上
3、分析物与流动相中的衍生试剂反应 方法适于不太稳定的衍生物，反应要快 所需衍生试剂量较大，昂贵的衍生试剂不应采用此法.,衍生试剂的构成与要求,衍生试剂必须含有可检测的基团，即显色团（chromophore）、荧光团（fluorophore）和电基团（electrophore） 含有反应基团如FITC,衍生试剂稳定 要纯，不含杂质， 形成一种衍生物，尽可能没有副产物形成 尽可能高衍生物产率； 需衍生试剂尽少，避免试剂峰的干扰. 对于柱后衍生试剂，同样须具有的共同条件外，应：（1）试剂与被分析物反应迅速；（2）衍生试剂转化率高，过量少，以免干扰衍生物的检测.,进展文献,邓樱花，王红，张华山，高效液相
4、色谱和毛细管电泳分离荧光检测小分子氨基生物物质的进展 ，分析科学学报，2010，26（1）：103,衍生试剂 种类与应用,胺的衍生试剂 巯基的衍生试剂 羟基的衍生试剂 羰基化合物的衍生试剂 羧酸的衍生试剂 分离对映体的手性衍生试剂,被衍生的氨基化合物,氨基酸 神经递质氨基酸 谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)、-丙氨酸(-Ala)、牛磺酸(Tau)等 神经递质 多巴胺、肾上腺素、去甲基肾上腺素 小肽和肽段 二甘肽，三甘肽，谷胱甘肽，脑啡肽等 磷酸化氨基酸 磷酸化丝氨酸(P-Ser)、磷酸化苏氨酸(P-Thr)和磷酸化酪氨酸 脂肪胺 生物胺 腐胺、尸胺
5、、精胺、亚精胺 蛋白质,胺的衍生试剂,芳香邻二醛类 异硫氰酸酯类 酰氯类 羰酰氯类 磺酰氯 活性卤类 N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类 其它,芳香邻二醛类,OPA、2，3-萘二醛（NDA）、3-（2-呋喃甲酰基）-喹啉-2-羰醛（FQCA）、3-（4-羧基苯甲酰基）-喹啉-2-羰醛（CBQCA）.,Fig.1-2. Typical electropherogram of a 500 nL aliquot of derivatized microdialysate from the rat striatum. The separation buffer was 75 mM borate buffer
6、(pH 9.2) containing 70 mM SDS and 10 mM HP-CD. IS was cysteic acid.,He-Cd 激光器,Electrophoresis 2003, 24, 31873196,2, 3-萘二醛(NDA)衍生CE-LIF分离检测活体中的GABA、Glu、L-Asp,检测限: 0.6-3 nM,.异硫氰酸酯类,苯异硫氰酸酯（PITC）,PITC PTC-氨基酸 PTH氨基酸,Edman试剂 紫外检测 254nm 衍生物稳定，分析时间也较短 副产物、溶剂等多种干扰因素可通过高效蒸发除去,较烦琐 30min内分离20余种氨基酸,4-N，N-对二甲胺基偶
7、氮苯-4-异硫氰酸酯（DABITC ）,4-（5，6-二甲氧基苯并噻唑）苯异硫氰酸酯,荧光素异硫氰酸酯（FITC）,J. Chromatogr. B, 2001, 758, 277-282,Fig. 1-1. Electropherogram of standard amino acids (each amino acids concentration: 2.510-8 M). (1)Arg, (2) Lys, (3) Gln (4) GABA, (5)Ala, (6) Gly, (7) Glu, (8) Asp, (a) FITC, (b) decomposition products of
8、 FITC.,下丘脑的神经递质氨基酸在运动中枢神经中起着重要作用,荧光素异硫氰酸酯(FITC)衍生CE-LIF分离测定大鼠下丘脑中的八种氨基酸,衍生条件：pH 10 硼砂缓冲溶液, 室温, 避光17 h,Fig. 1-3. Typical chromatogram of SIFA derivatives with amines.Mobile phase: methanolwater (46/54, v/v) solution containing10 mmol/L pH 5.40 citric acidNa2HPO4 buffer; amine concentration: 0.1 mmol/
9、L; fluorescence detection wavelengths: ex/em = 488/516 nm. (1) Methylamine (2) ethylamine (3) ethylene diamine (4) FOAA (hydrolyzed product of SIFA) (5) isopropylamine (6) isobutylamine (7) n-butylamine (8)1,4-butylene diamine (9) 1,5-amylene diamine. Reprinted from ref.197 ,酰氯类,磺酰氯类（-SO2Cl） 和羰酰氯（-C
10、OCl）,丹磺酰氯 DNS-Cl.,5-二甲氨基-1-萘磺酰氯，熔点69-71oC 激发波长350nm，发射波长530nm. 衍生反应所30min到2h 非水溶液衍生时间较短 衍生物产率受介质pH值和水的含量影响 稳定12-24h，对紫外光比较敏感，衍生反应须避光进行，衍生物要避光存放. 测定了22种氨基酸并用于人体血浆样品，检测限1.0pmol 紫外检测，灵敏度低，检出限仅50-100pmol.,ODS柱（1254.6mm，3m）；流动相：A，3%四氢呋喃的15mmol/L磷酸钠缓冲 溶液（pH6.3）；B，60%乙晴的15mmol/L磷酸钠缓冲溶液（pH6.3）；梯度淋洗； 柱温，25oC
11、，荧光检测，ex330nm，em550nm,其它磺酰氯衍生试剂,p-4，4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl） 5，5-二丁氨基-1-萘磺酰氯（BNS-Cl） N-甲基-2-苯胺基萘-6-磺酰氯 4-萘-1-偶氮-（4-二甲氨基苯）磺酰氯 香豆素-6-磺酰氯（C-6-SO2Cl）,羰酰氯,9-芴甲基氯甲酸酯，9-芴甲氧基羰酰氯（FMOC-Cl） ex265nm，em310nm 在室温和碱性条件下，衍生反应30s完成.衍生产物很稳定 二元梯度淋洗，23min分离了22种生理氨基酸 检出限1.0pmol 测定地下水中的二甲基胺64和法国红酒中组胺、精胺等生物胺 FMOC-Cl的水解产物有相似的
12、荧光强度，上柱分离前须除去，戊烷萃取,SuperspherCH-8（1254.0mm）；流动相：A，20%乙晴的50mmol/L乙酸钠缓冲 溶液（pH4.2）；B，70%乙晴的50mmol/L乙酸钠缓冲溶液（pH4.2）；梯度淋洗； 柱温，35oC，荧光检测，ex265nm，em310nm,Fig.1-1Comparison of separation of 5 FMOC-Cl derivatized neurotransmitter amino acids in N-MEKC and RM-MEKC with reversed migration elution order. Sample:
13、 a neurotransmitter amino acid standard. Separation conditions, background electrolyte, 60 mmol/L boric acid-NaOH (pH 8.60), 40 mmol/L SDS; capillary 55 cm (47 cm to detector window)350 mm I.D., (a) uncoated capillary,125 kV, 24 mA; (b) coated capillary, 225 kV, 24 mA. Sample concentration, 200 mmol
14、/L; injection; 50 mbar, 10 s. Reprinted from ref. 107.,3，4-二氢-6，7-二甲氧基4-甲基-3-喹恶啉-2-羰酰氯（DMMQC-Cl）,6-甲氧基-2-甲基磺酰-喹啉-4-羰酰氯 （MSQC-Cl）,活性卤类,可与一、二级胺反应,NBD-Cl作为荧光生成试剂用于衍生脂肪胺及氨基酸在弱碱性溶液中进行 NBD-Cl是一个选择性相当好的衍生试剂，虽然它也与醇（-OH）、硫酚（-SH）和苯胺反应 衍生物的荧光强度比脂肪胺低很多 衍生物显示出激发波长最大在480nm，适合Ar离子激发波长,NBD-F与氨基乙酸的反应速度比NBD-Cl快500倍在p
15、H8.0、60oC及避光 5min内就与氨基酸完成反应. 手性柱上氨基酸对映体的分离. NBD-Cl与二级氨基酸反应的活性更好. NBD-胺结合物在水中的荧光量子产率很低，小于0.01；而在甲醇溶液中大大增加. DBD-F在pH8.0和50oC，反应2h，DBD-F与氨基化合物同样生成衍生物，用于反相色谱分离氨基酸和脂肪胺类，激发波长466-469nm，检测发射波长594-600nm，检出限亚pmol级 ABD-F的胺衍生物的激发和发射波长紫移，分别为450nm和590nm；荧光强度低2.5倍.,2，4-二硝基氟苯是在紫外光区有吸收峰的含活性卤原子的HPLC分离氨基酸的柱前衍生试剂,400nm
16、 在温和条件（pH8-9，室温）与一、二级氨基酸均能反应，衍生物稳定 紫外检测，灵敏度较低，多应用于测定蛋白质的N-末端氨基酸残基,N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类,氨基甲酸酯类（AQC）和羧酸酯（SIIA）,荧光素-O-乙酸酯（FL-O-Ac-SE ),9-氰基-N，N，N，-三乙基-N-（5-琥珀酰亚胺氧羰基戊基）焦宁氯化物（Pyronin SE）近红外的活性酯荧光衍生试剂，,em=695nm，衍生氨基酸，CE分离，激光诱导荧光检测限达0.8-4.5amol,琥珀酰亚胺-4，4二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸酯（BODIPY-C3-SE）,琥珀酰亚胺-9-芴甲氧基甲酸酯（FMOC-SE）,Fig. 1-3. Electropherograms obtained for separations of five DTAF labeling phosphoamino and amino acids in pH 9.3 borat
