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1、附件4含乳饮料及其乳原料中酪蛋白含量的测定BJS 2019151 范围 本方法规定了含乳饮料及其原料中酪蛋白四种亚型s1-酪蛋白、s2-酪蛋白、-酪蛋白、-酪蛋白含量测定的方法。 本标准适用于含乳饮料及其原料中酪蛋白总含量的测定，不适用于发酵法、酶解法、水解法等工艺对蛋白质改性的样品。2 原理试样溶液中的酪蛋白采用等电点沉淀后复溶，用胰蛋白酶进行酶解，同时加入同位素内标，C18水相柱分离，采用液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。 3试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1 浓盐酸（HCl）。3.1.2 甲酸（CH2O2）：质谱
2、级。3.1.3 醋酸（CH3COOH）：色谱级。3.1.4 氯化钠（NaCl）。3.1.5 乙腈（CH3CN）：质谱级。3.1.6 三羟甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3）。3.1.7 聚乙二醇辛基苯基醚 （Triton X-100, C34H62O11）。3.1.8 胰蛋白酶（Trypsin，C6H15O12P3）：质谱级，猪源、牛源、基因工程来源均可；建议采用基因工程级的胰蛋白酶以降低杂酶的影响。3.2 试剂配制3.2.1 盐酸溶液（6 mol/L）：吸取25 mL 浓盐酸，用水稀释并定容至50 mL。3.2.2 甲酸溶液（10% V/V）：吸取1 mL甲酸，用水稀释并定容至10 m
3、L。3.2.3 醋酸溶液（0.3% V/V）：吸取0.3 mL醋酸，用水稀释并定容至100 mL。3.2.4 氯化钠溶液 （0.5 mol/L，含0.2% Triton-X 100）：称取14.625 g，加200 mL水溶解后，加入1 mL Triton X-100（3.1.7），混匀溶解后，用水定容至500 mL。3.2.5 Tris-HCl溶液（50 mmol/L）：称取6.057 g Tris，加900 mL水溶解，用6 mol/L盐酸溶液（3.2.1）调pH至8.5后，用水定容至1000 mL，经0.45 m微孔滤膜过滤，备用。3.2.6 胰蛋白酶液：用醋酸溶液（3.2.3）将胰蛋白
4、酶粉末溶解至1 mg/mL后，按照单次使用量进行稀释分装，如每瓶50 L或100L的0.2 mg/mL胰蛋白酶，-80C冷冻保存，避免反复冻融。3.2.7 蛋白质浓度测定试剂盒（基于考马斯亮蓝-Bradford测定法或BCA蛋白质测定法均可）。3.2.8 甲酸水溶液（0.1% V/V）：吸取0.5 mL甲酸，用水稀释并定容至500 mL。3.3 标准品3.3.1 s1-酪蛋白特征肽标准品：YLGYLEQLLR，纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。3.3.2 s2-酪蛋白特征肽标准品：FALPQYLK，纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。3.3.3 -酪蛋白特征肽标准品：VLPVPQK，
5、纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。3.3.4 -酪蛋白特征肽标准品：YIPIQYVLSR，纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。3.3.5 s1-酪蛋白特征肽内标标准品：PSERYLGYL*（13C6，15N）EQLLRLKKY，HPLC级纯度 98%。3.3.6 s2-酪蛋白特征肽内标标准品：RYQKFALPQYL*（13C6，15N）KTVYQ，HPLC级纯度 98%。3.3.7 -酪蛋白特征肽内标标准品：SQSKVL*（13C6，15N）PVPQKAVPY，HPLC级纯度 98%。3.3.8 -酪蛋白特征肽内标标准品：KIAKYIPIQYVL*（13C6，15N）SRYPSY，H
6、PLC级纯度 98%。L*（13C6，15N）同位素标记亮氨酸，以上标准品的相对分子量见附录A表A1。3.4标准溶液配制3.4.1 标准储备溶液（400 mol/L）：根据标准品纯度及肽段标准品相对分子量计算不同酪蛋白亚型（3.3.1-3.3.4）称样量，精确称取适量（精确至0.01 mg）标准品后，用Tris-HCl溶液（3.2.5）溶解，定容于10 mL 容量瓶中，各酪蛋白亚型特征肽（3.3.1-3.3.4）浓度均为400 mol/L，此溶液密封后-20冷冻保存，有效期3个月。3.4.2 混合标准溶液：准确吸取各酪蛋白亚型特征肽标准储备液（3.4.1）1 mL至100 mL容量瓶中，加入T
7、ris-HCl溶液（3.2.5）稀释至刻度，得到各酪蛋白亚型特征肽浓度为4 mol/L 的混合标准溶液，此溶液密封后-20冷冻保存，有效期1个月。3.4.3 混合标准工作溶液：准确吸取混合标准溶液（3.4.2），用纯水稀释，配制成浓度依次为0.02 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、1.0 mol/L、2 mol/L 的系列混合标准工作液， -20冷冻保存，有效期1周。3.4.4 内标标准储备溶液（10 mol/L）：根据标准品纯度及肽段标准品相对分子量计算不同酪蛋白亚型（3.3.5-3.3.8）称样量，精确称取适量（精确至0.01 mg）内标标准品后，用Tris-HCl溶液
8、（3.2.5）溶解，配制成各酪蛋白亚型特征肽（3.3.5-3.3.8）浓度均为10 mol/L的内标标准储备溶液，此溶液密封后-20冷冻保存，有效期3个月。3.4.5 内标混合标准溶液：准确分别吸取0.25 mL各酪蛋白亚型特征肽内标标准储备溶液（3.4.4）混合，配制成浓度为2.5 mol/L 内标混合标准溶液1 mL，-20冷冻保存，有效期1个月。3.4.6 混合标准品酶解溶液：分别准确吸取500 L 各系列混合标准工作溶液（3.4.3）到2 mL低吸附聚丙烯（PP）离心管中，向每个浓度中加入40 L 内标混合标准溶液（3.4.5），再加入5 L的 0.2 mg/mL的胰蛋白酶液（3.2.
9、6） （含1 g胰蛋白酶），用纯水定容至1 mL后充分涡旋，在1000 r/min，4条件下，离心1 min。盖紧瓶盖，在37水浴或者恒温箱内孵育15-16 h后，取出加入20 L 10% 的甲酸溶液（3.2.2）终止酶解反应。混匀后，在10 000 r/min，4条件下离心10 min，静置，取上清液备用。上清液在-20冷冻保存放置4-5天内稳定。3.5材料3.5.1 低吸附型2 mL、15 mL、50 mL聚丙烯（PP）离心管。3.5.2 低吸附型聚丙烯（PP）枪头。3.5.3 低吸附型聚苯乙烯（PS）96孔板（用于总蛋白含量测定）。4 仪器和设备4.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾
10、离子源。4.2 酶标仪。4.3分析天平：感量分别为0.001 g、0.000 1 g和0.000 01 g。4.4低温离心机：转速6 000 r/min。4.5恒温水浴锅或可控温培养箱。4.6 pH计。4.7涡旋振荡器。5分析步骤5.1 试样蛋白提取含乳饮料固体试样（若含乳包装为独立包装，应与其他调味粉末混合后取样，例如：咖啡、奶茶等饮品）：试样称取1 g5 g (精确至0.001 g) 于锥形瓶中；若为乳饮料液体试样：精密量取试样10 mL 于锥形瓶中，加入30 mL 预温（40）的Tris-HCl溶液（3.2.5），混匀后，放入60水浴恒温振荡1 h，取出冷却后用Tris-HCl溶液（3.
11、2.5）转移定容至50 mL容量瓶（V溶解体积）。乳粉原料粉试样：称取试样0.5 g1 g (精确至0.001 g) 于锥形瓶中；若为液体乳试样：精密量取试样12 mL 于锥形瓶中，加入30 mL 预温（40）的Tris-HCl溶液（3.2.5），混匀后，放入60水浴恒温振荡1 h，取出冷却后用Tris-HCl溶液（3.2.5）转移定容至50 mL容量瓶（V溶解体积）。精密量取10 mL（V沉淀体积）上述完全溶解的试样溶液（视检无明显结块），按体积比（v/v =1:1）加入10 mL 氯化钠溶液（3.2.4）, 涡旋振荡。混匀后，用10% 甲酸溶液（3.2.2）调节试样的pH值到4.64.8之
12、间，2-8条件下静置过夜，待所有蛋白沉淀析出。已析出的沉淀试样在10000 r/min，4条件下离心15 min，弃去上清液，沉淀以备复溶。5.2 试样复溶 向上述沉淀试样（5.1）中加入5 mL Tris-HCl溶液（3.2.5），涡旋振荡 510 min，使溶液充分溶解，放入60水浴恒温振荡30 min，取出后继续混匀（视检无明显结块）。试样溶液在10 000 r/min， 4条件下离心15 min，弃去沉淀，留取上清液。上述步骤重复1次，合并两次复溶的上清液后，可用Tris-HCl溶液（3.2.5）定容至10 mL（V复溶体积）。5.3 试样总蛋白的含量测定 按照Bradford或BCA
13、法试剂盒所述方法测定复溶试样溶液（5.2）中总蛋白质的含量（单位：mg/mL）。5.4 试样的稀释 为保证该实验在最佳的酶解效率下进行，需根据试样中总蛋白的含量测定结果（5.3）, 用Tris-HCl溶液（3.2.5）对复溶后的试样溶液进行稀释（f3稀释倍数），使试样稀释液中的总蛋白含量保持在0.2 mg/mL0.7 mg/mL之间。5.5 试样的酶解该实验的最佳酶解效率为：酶的质量/总蛋白质量（w/w）=1:20，根据此原则推算，若试样稀释液中总蛋白含量在0.2 mg/mL0.7 mg/mL之间，按取样量200 L进行酶解（V酶解体积），则其对应的总蛋白质质量范围在40 g140 g之间，加
14、入胰蛋白酶的量则在2 g7 g范围内。取 200 L （V酶解体积）稀释后的试样（5.4），按照上述计算依据，加入适量胰蛋白酶液（3.2.6），向试样中加入 40 L 内标混合标准溶液（3.4.5），用纯水定容至1 mL（V定容体积）后充分涡旋，在1000 r/min，4条件下，离心1 min。盖紧瓶盖，在37水浴或者恒温箱内孵育15-16 h后，取出加入20 L 10% 的甲酸溶液（3.2.2）终止酶解反应。混匀后，在10000 r/min，4条件下离心10 min，静置，上清液以备分析。注：当回收率达不到本标准要求时，应考虑对蛋白酶活力进行评价。可以选用市售标准蛋白质质控样品（标明准确蛋白
15、含量且已知目标肽段分子量的产品）随行酶解步骤，检测评估及控制。5.6 仪器参考条件5.6.1 液相色谱参考条件a) 色谱柱：C18亲水柱（T3），柱长100 mm，内径2.1 mm，粒径 1.8 m，填料孔径 100或性能相当者；b）流动相：流动相A为0.1%甲酸-水溶液（3.2.8），流动相B为乙腈（3.1.5），参考梯度洗脱程序见表1；c) 流速：0.3 mL/min；d）柱温：30；e）进样量：5 L；表1 参考梯度洗脱程序时间(min)A：0.1%甲酸-水溶液（%）B：乙腈（%）09550.59554.550504.635656.635656.79559.09555.6.2 质谱参考条件a) 离子源：电喷雾离子源；b）扫描方式：正离子扫描；c）监测方式：多反应监测模式,酪蛋白母离子、子离子和碰撞能量见表2。d）毛细管电压：3 500V；e）锥孔电压：10 V；f）离子源温度：150 ；g）偏转电压：50 V；h）锥孔气流量：150 L/h；i）脱溶剂气温度：500 ；j）脱溶剂气流速：800 L/h；表2 酪蛋
