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1、蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析,张绍进,Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析,Western Blot 简介：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电
2、泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,Western Blot 基本原理,Western Blot 优点,高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5ng中等大小的靶蛋白,Western Blot应用,目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析,Western Blot 流程,蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取
3、法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,蛋白样品的提取,蛋白样品的定量,目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。 蛋白质浓度测定的各种方法汇总： ,蛋白样品的变性,2SDS-PAGE上样缓冲液： DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。 按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20
4、-25l，总蛋白量2050g。,SDS：,阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,蛋白质-SDS胶束的特点：,（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g 蛋白质结合1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比,不连续的电泳缓冲体系。 SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于
5、蛋白质分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。,【
6、SDS-PAGE基本原理】,凝胶成分,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液,PAGE：聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。,聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：,单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲
7、叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶,聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光化学催化（核黄素TMTED）体系。,凝胶浓度与蛋白分离范围,SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方表：,不连续电泳：,电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。,灌制分离胶 隔绝空气,ddH2O 0.1%SDS:8%,灌制积层胶 插入梳子,转膜
8、,要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。,转移膜的选择,最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍： ,湿转系统,半干转移系统,丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤
9、维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。,转膜后检测（此步可以省略）,封闭,为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,一抗、二抗孵育,把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每
10、次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP),膜解吸方法（膜的重复利用）,通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。 酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。,Western Blot结果分析,目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表
11、某样品的目的蛋白相对含量。 Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程）,Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电
12、泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,SDS-PAGE电泳,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,转移到膜上的蛋白很少,背景太高,杂交信号很弱,出现非特异带,Further Readings,生物秀Western Blotting专题 Millipore的蛋白印迹手册 Bio-Rad的western Blotting操作手册 Western blot问题解答专帖 ,谢谢大家！,
