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1、磷脂原位凝胶- 一种新的注射用长效缓释给药系统,1,生物技术药物制剂,问题,稳定性差,存在显著的首过效应 生物半衰期短,消除快,2,注射用长效缓控释给药系统的优点,可减少给药次数, 提高患者的顺应性。 稳定的血药浓度, 避免了峰谷现象。 直接注入治疗部位, 可降低系统毒性。 缓释制剂因提高治疗效果, 以及减少了制剂配发、 服药和监护等健康护理时间, 而使总的治疗费用降低。,刺痛,患者的顺应性差; 血药浓度变化大。,普通注射给药的缺点:,3,生物半衰期短,原位凝胶 PLGA微球,4,原位凝胶,是一类以溶液状态给药后,能在用药部位立即发生相转变,由液态转化成非化学交联半固体凝胶的制剂。 分类: 在
2、研:温度敏感型,pH敏感型,离子敏感型,光敏感型等。 应用:扩散沉淀型(聚合物、蔗糖酯) 材料:天然或化学合成高分子聚合物,如壳聚糖,帕洛沙姆,PEG/PLGA, PEG/PPO,卡波姆等。,5,原位凝胶,市售产品:Eligard 、 Atrigel 、Atrisorb 基本材料:PLGA / NMP 优点:缓释时间可调节幅度较大,6,磷脂 凝胶,处 方 组 成,减少乙醇刺激性,新型磷脂凝胶缓释递药系统,7,磷脂,易溶于乙醇,内源性成分,价廉易得,可生物降解,应用安全,不溶于水,新型磷脂凝胶缓释递药系统,8,磷脂溶于乙醇中,形成澄清透明低粘度的可注射液体。,磷脂析出,形成半固体凝胶状药物储库,
3、缓慢释药。,醇溶 解性,水不 溶性,皮下注射,乙醇扩散,水分渗入,形 成 机 制,9,磷脂凝胶的处方,10,制剂外观性质,外观:澄清透明,初始粘度: 低( 200 cP),可注射; 加MCT者粘度增加,PPSG-70最显著,11,含水量增加,粘度增加,PPSG 70最显著,制剂粘度随含水量的变化,迅速的相转变,控制突释,高粘度,缓释药,较大的固化区 域(68.9%),12,凝胶相转变中的微观形态,加MCT或水分渗入 微粒析出 增加粘度,缓慢释药,13,凝胶在水中的溶剂扩散行为,乙醇扩散速率:药物释放过程,PPSG-40-(-) PPSG-40-(+) PPSG-70-(-) PPSG-70-(
4、+),水分渗入速率:磷脂固化过程,14,局部刺激性评价,未见明 显刺激性,15,磷脂凝胶在多种药物上的应用,多肽类药物:醋酸奥曲肽、醋酸艾塞那肽 小分子化学药物:盐酸阿霉素、匹伐他汀钙,16,释放曲线,奥曲肽磷脂凝胶的体外释放,17,奥曲肽磷脂凝胶的体外释放,状态变化:,澄清固化浑浊,18,药时曲线: a.溶液组 b.微球肌肉注射 c.微球皮下注射 d.PPSG-70(+)皮下注射,奥曲肽磷脂凝胶的体内药动学结果,缓释一个月,大鼠皮下注射凝胶PPSG-70(+)后,迅速固化形成药物储库,19,20,磷脂凝胶在体内逐渐降解,(n=3),奥曲肽磷脂凝胶的体内形态变化,实验动物:雄性昆明小鼠30只,
5、体重25-30g 模型建立方法:每只小鼠于左腋窝皮下注射H-22小鼠肝癌细胞株细胞 实验分组:将30只小鼠称重后随机分为3组,每组10只。 A为对照组(生理盐水组):皮下接种肿瘤24h后予以相同容积无菌生理盐水腹腔注射,每日一次,连用14d; B为实验组(制剂组):皮下接种肿瘤24h后皮下注射一次醋酸奥曲肽凝胶制剂1.4mg/kg(以14d给药量计),给药体积为0.2ml ; C为阳性组(溶液组):皮下接种肿瘤24h后腹腔注射奥曲肽溶液100g/kgd,每日一次,连用14d 。 实验方法:在一定的时间点应用游标卡尺测量肿瘤的长径和宽径,最后一次注射后处死小鼠,切除肿瘤,4%多聚甲醛固定,包埋,
6、连续切片后行常规HE染色和免疫组织化学染色,异位瘤实验方案,奥曲肽磷脂凝胶的药效学结果,21,以测量时间(d)为横坐标,以肿瘤体积的对数值为纵坐标作图。,异位瘤实验结果,奥曲肽磷脂凝胶的药效学结果,22,HE染色结果,A为OCT溶液组 B为OCT凝胶制剂组 C为生理组 HE结果表明: A组肿瘤坏死明显,残存肿瘤细胞中可见较多的凋亡细胞及碎片,血管及相关增殖情况不明。 B组能够清楚看到肿瘤大片坏死,大多数仅存少量肿瘤细胞残影,故无法看清血管及相关增殖情况(核分裂等)。 C组能够看到肿瘤中央间或出现肿瘤性缺血坏死灶,细胞呈片状生长,分化程度低,核浆比例大,细胞深染,未见明显核分裂。 肿瘤细胞坏死程
7、度: 制剂组溶液组生理组,23,40倍,200倍,奥曲肽磷脂凝胶的药效学结果,溶液组和制剂组的血管稀疏,而生理组的血管密集,生理组的ki-67呈现高表达,而制剂组和溶液组呈现低表达,且制剂组的表达最低,提示制剂组细胞增殖最为缓慢,而生理组细胞增殖最快。,溶液组的tunel呈现高表达,制剂组呈现中度表达,而生理组呈现低表达,提示溶液组细胞凋亡情况最为严重。,A为OCT溶液组,B为OCT凝胶制剂组,C为生理盐水组,奥曲肽磷脂凝胶的药效学结果,24,实验动物:5周龄雄性SD大鼠(100-150g) 模型建立方法:适应环境1周后,腹腔注射一次100mg/kg的二乙基亚硝胺(DEN)并开始给予含有100
8、mg/L亚硝基吗啉的饮用水,每只给予40ml,每隔一天更换一次新配制的含有亚硝基吗啉的饮用水,持续8周。 实验分组: 生理盐水组(n=10):从第8周起,饮用正常自来水。实验开始后每隔一天给大鼠皮下注射1ml/kg的生理盐水。 阳性对照组(n=10):从第8周起,饮用正常自来水。实验开始后每隔一天给大鼠皮下注射市售处方的奥曲肽溶液,给药剂量为0.2mg/kg。 凝胶制剂组(n=10): 从第8周起,饮用正常自来水。实验首日给大鼠皮下注射OCT凝胶制剂,给药剂量为6mg/kg,给药体积为0.7ml。 实验方法: 按照分组情况,大鼠自由饮食,饮用含有亚硝基吗啉的饮用水,并按照既定方式给药。于16周
9、处死所有老鼠,股动脉放血后迅速取出其肝脏并且固定,测定血中VEGF水平,并将固定后的肝脏石蜡包埋,切片后行HE染色和免疫组化研究。,原位肝癌模型实验方案,奥曲肽磷脂凝胶的药效学结果,25,A为OCT溶液组,B为OCT凝胶制剂组,C为生理盐水组。 HE染色结果: A,B组周围肝组织水肿(水样变性+),可见界限清楚的结节,推挤周围肝组织,中央可见血管扩张;肝细胞体积核大,深染,核仁清,脱质嗜碱性,结合大体考虑瘤性结节。 C组原发性肝细胞癌,肝细胞水肿(+),给予醋酸奥曲肽的A、B组血清中VEGF水平明显低于生理盐水组。,原位肝癌模型实验结果,奥曲肽磷脂凝胶的药效学结果,26,药代动力学研究,醋酸艾
10、塞那肽磷脂凝胶,27,将异硫氰酸荧光素(FITC)溶解于乙醇中,将艾塞那肽溶解于的碳酸盐缓冲液中,混合室温反应,纯化,冻干。 将得到的FITC-exenatide与空白磷脂原位凝胶混合。,FITC-exenatide 磷脂原位凝胶 的制备,给药方案,将大鼠随机分为两组,每组 5只。 制剂组:给大鼠背部皮下注射 1g FITC-exenatide磷脂原位凝胶。 溶液组:给大鼠背部皮下注射1ml FITC-exenatide水溶液,浓度为150g/ml。,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,28,药时曲线,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,29,药动学参数,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,30,药效学研究大鼠,一、造模-二型糖尿病大
11、鼠 分别用普通饲料和高糖高脂饲料喂养wista 雄性大鼠,约10周后,高糖高脂组大鼠相对于普通饲料喂养的大鼠体重增加更明显,更重要的是会出现胰岛素抵抗现象。 体重测定:电子秤 胰岛素抵抗现象观察:口服耐糖实验,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,32,分别用普通饲料和高糖高脂饲料饲喂大鼠,约10周。体重(g)变化如下:,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,33,口服耐糖实验: 取高脂组大鼠与对照组大鼠各 5只,禁食 12 h,自由饮水,称体重后,灌胃给予30%葡萄糖溶液,给药剂量为 2 g/kg,分别在 0、15、30、60、120、180 min 于大鼠尾静脉取血,取少部分血液直接用罗氏血糖仪测定其血糖值,剩余的血液在
12、室温下凝结 30 min 后,离心(5000 rpm,15 min),取血清于-20 冻存备用。将取得的血清用胰岛素 ELISA 试剂盒测定其胰岛素浓度。,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,34,口服耐糖实验结果: 血糖值(mmol/L)随时间(min)的变化,大鼠胰岛素水平(ng/ml)随时间的变化:,说明为了达到相同的降糖效果,高脂组大鼠需要分泌更多的胰岛素,其形成了明显的胰岛素抵抗。,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,35,将产生胰岛素抵抗的大鼠禁食18 h,自由饮水,称其体重。称取链脲佐菌素 STZ,溶于适量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(pH 4.5),按 25 mg/kg剂量立即腹腔注射,连续腹腔注射3 d后,
13、继续高脂饲料饲养 7 d。禁食后,于尾静脉取血,用罗氏血糖仪测定其空腹血糖值,选择血糖值大于 11.0 mmol/L的大鼠,即糖尿病大鼠用于试验。,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,36,诱导2型糖尿病大鼠模型,二、给药方案 A:药物制剂组(n=5):糖尿病大鼠皮下注射给予艾塞那肽磷脂凝胶 B:药物溶液组(n=5):糖尿病大鼠皮下注射给予艾塞那肽溶液(给药剂量10g/Kg/次,一天给药两次,给药时间间隔 8小时) C:生理盐水组(n=5):糖尿病大鼠皮下注射给予生理盐水(一天给予两次,给予时间间隔8小时),醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,37,三、实验结果,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,38,血糖变化情况,药效学研究小鼠,
14、研究采用db 小鼠来对艾塞那肽磷脂原位凝胶的药效进行研究。 db小鼠是一种自发型糖尿病模型,它是由一种基因自发突变C57小鼠回交而来,在生长发育过程中表现出肥胖、高血糖、高胰岛素血症, 甘油三酯、总胆固醇水平升高,胰岛功能不足,肝脏肾脏心脏病变,适用于进行二型糖尿病研究。,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,39,一、分组及给药方案 共19只雌性d/b小鼠,分为三组,其中制剂组7只,溶液组6只,生理盐水组6只。实验过程中溶液组死亡一只。先测定初始血糖和体重后,制剂组每只小鼠皮下注射0.5g磷脂凝胶,共含Exenatide(EXT)150ug,溶液组每只小鼠每天接受两次EXT溶液(50ug/ml)皮下注射,每
15、次剂量为5ug,生理盐水组每只小鼠每天接受两次生理盐水皮下注射,每次剂量为0.1ml.,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,40,二、观测指标及测定方法 每天测定小鼠的血糖,直到制剂组小鼠血糖失去控制后所有小鼠眼眶采血约0.8ml,一部分血液用EDTA抗凝后测定HbA1c值,另一部分离心后取血浆测定胰岛素含量,最后处死所有小鼠,取出胰腺,固定染色后,用光学显微镜观察切片。 血糖值:罗氏血糖仪测定 HbA1c:糖化血红蛋白测定仪 Insulin: Ellisa 试剂盒 切片:多聚甲醛固定,石蜡包埋,HE染色,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,41,三、观测结果 血糖,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,42,血红蛋白HbA1c 值,醋
16、酸艾塞那肽磷脂凝胶,胰岛素含量,43,胰腺组织切片,1010倍,2010倍,醋酸艾塞那肽磷脂凝胶,a.制剂组,b. 溶液组,C. 生理盐水组,44,证实了制剂对胰腺的保护作用,其促进了胰岛细胞的再生,从而刺激胰岛素分泌。,研究总结,载体组成:小分子材料构成;生物相容性好;制备简单; 药代动力学:缓释良好;突释较弱; 体内药效学:缓释长效,药效可达2周-1个月。,总之,磷脂原位凝胶是一种具有良好开发前景的注射用缓控释制剂。,45,46,Thank You !,原位凝胶+瘤内给药,研究背景,盐酸阿霉素磷脂凝胶,45,盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride),阿霉素分子结构,盐酸阿霉素磷脂凝胶,46,处方: E80(72%) MCT(17%) 无水乙醇(11%) 盐酸阿霉素,盐酸阿霉素磷脂凝胶,47,荷瘤动物模型的建立 小鼠肉瘤S180细胞株;昆明小鼠 实验分组及给药 (1)PME-D组,瘤内