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1、实验八 蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定,(1)了解重组蛋白表达的方法和意义。 (2)了解亲和层析分离纯化的方法。,实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。,本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的
2、次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。,材料与试剂,试剂 1 LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. 2 氨苄青霉素：100mg/mL 3 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM 2-ME, pH8.0 4 Washing Buffer（UWB）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6
3、.3 5 Elution Buffer(洗脱): 100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 6 IPTG,实验步骤,一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中 （含100ug/mL 氨苄青霉素），37震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmo
4、l/l, 37继续培养1-3h. 4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20或-70冰箱中。,二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化 1.重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB, 用吸管抽吸重悬, 4 12000rpm 离心 30 min, 将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。 2. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟 ) 。 3. 细胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出
5、液。 4.洗脱杂蛋白：用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱，分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。 5.洗脱目标蛋白：用10mL洗脱缓冲液洗柱，每管0.51 mL，共收集610管，分别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。,1装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 2制分离胶：按所需的浓度配制12.5分离胶。,灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）,3制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配方如下：,4. 灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳
6、缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。,5加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。 6电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，停止电泳。,7翘开玻璃板，将浓缩胶切掉, 剥下凝胶，准备染色。 8 凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25%乙醇，75%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，
7、每次10分钟。,注意事项 (1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。 (2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。 (3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。 (4) 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。 （6）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。 (7) 稀释5SDS/电泳缓冲液至1浓度灌入电泳槽，需800毫升。,1.将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使
8、之形成一个间隙。,2.在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。,3.将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。,4.取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。,5.将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。,6.如图所示将电极架往下压（约12mm），使底面完全接触。,7.关上底座开关。,8.放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用的梳子齿数必须一致。,
