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1、实验一、血涂片的制备和染色【原理】 将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。【器材】1载玻片 使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。2推片 选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm宽度的推片。3吸耳球。4显微镜。5酒精灯。6
2、采血针。7注射器和针头。【试剂】1瑞氏（Wright）染液（1）液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油密闭保存。（2）液：磷酸盐缓冲液（pH6.46.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可
3、用新鲜蒸馏水代替。2吉姆萨染液 包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。3瑞-吉复合染液（1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。将瑞氏染料和吉姆萨染料置洁净研钵中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各摇3min，共5d，以后存放1周即能使用。（2）液：即磷酸盐缓冲液（pH6.46.8）。包含无水磷酸二氢钾6.64g、无水磷酸氢二钠2.56g，加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000
4、ml。【操作】1采血 （1）静脉采血法：用EDTAK2抗凝12h内的标本，使用玻棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血，直径约4mm。（2）皮肤采血法：选择第三、四手指，并先采红细胞、白细胞计数，再采血1滴置洁净玻片上用于血涂片制备。2制作涂片 左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方，右手持推片从后方移动接近血滴，使血液沿推片边缘展开，将推片与载玻片呈3045角，用均匀速度向前将血液推成厚薄适宜的血涂片，血涂片应呈舌状，头、体、尾三部分，且清晰可见。所有血液必须在推片到达末端前用完。推大于一片血片。贫血病人推片速度要快。3干燥涂片 空气干燥：迅速干燥。4标记涂片 在载玻片的
5、一端用记号笔编号，注明患者姓名或门诊/住院号。5染色（1）瑞氏染色法：待血涂片干透后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。然后将玻片平置于染色架上，滴加染液（I液）35滴，使其迅速盖满血涂片，约0.51min后，滴加等量或稍多的缓冲液（液），轻轻摇动玻片或用吸球对准血涂片吹气，使染液充分混合。510min后用流水冲去染液，待干。（2）吉姆萨染色法：将固定的血涂片置于被pH6.46.8磷酸盐缓冲液稀释1020倍的吉姆萨染液中，浸染1030min（标本较少可用滴染）。取出用流水冲洗，待干燥后显微镜检查。（3）瑞一吉复合染色法：操作步骤同瑞氏染色法，只是染色时将瑞一吉复合染液液和液替代瑞氏染液的液
6、和液。6观察结果 将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。观察后显微镜擦拭。【注意事项】 1瑞氏染液 新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青B后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青B愈多，染色效果愈好，但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。甲醇必须用AR（无丙酮）。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发，
7、使细胞染色较清晰。2采血（1）不能采集以下部位的血液：示指或拇指血液。感染部位血液，如甲沟炎。耳垂部位血液，含单核细胞太多。（2）不能使用肝素抗凝标本。（3）玻片必须清洁、干燥、无尘。新玻片：应在清洁液中浸泡过夜，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。已用过的玻片：应在60清洁液中加热20min，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。边缘破碎、表面有划痕的玻片不能再用。（4）使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。3制作涂片 许多因素可影响血涂片的厚度，针对不同患者应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的患者应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大
8、角度、快推。涂片质量不佳可能原因不规则间断和尾部太长推片污染、推片速度不连续、载玻片太脏有空洞载玻片污染脂肪、油脂白细胞和血小板尾部分布不规则制片技术差涂片太长或太短推片角度不佳涂片没有尾部血滴太大涂片很短血滴太小涂片没有边缘空隙推片太宽有细胞退变现象固定延迟、固定时间太短、甲醇污染血涂片厚血滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快白细胞破损推片时用力过猛4干燥涂片 血涂片干透后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。5染色步骤（1）操作注意事项及操作不当的后果见表1-3。操作注意事项操作不当的后果加染液应适量过少则易蒸发沉淀，一旦染料沉积在血涂片上，则不易冲洗，使细
9、胞深染不易检查。冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲洗染料沉着在血涂片上冲洗时间不能过久脱色冲洗完的血涂片应立放于支架上剩余水分浸泡脱色（2）染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关。染液淡、室温低、细胞多则染色时间要长；反之，可减少染色时间。必要时可增加染液量或延长时间。冲洗前，应先在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚，核质是否分明。应该在具体实践中摸索合适的时间，特别是在更换染液时。每批染色液和缓冲液，均需试染，以便掌握染色时间和加缓冲液的比例。6结果观察 低倍镜下观察血涂片应厚薄适宜，细胞不重叠，头尾及两侧有一定的空隙，一些体积大的特殊细胞常在血涂片的尾部出现。如有可能，干燥后的血涂片先用中性树
10、胶封片后再观察，不仅能长期保存血涂片，而且观察效果更佳。染色效果可能原因纠正措施太蓝涂片太厚、冲洗时间太短、中性水pH太高、染色时间太长、稀释染液重复使用、贮存染液暴露于阳光在含1硼酸的95乙醇溶液冲洗2次，用中性水冲洗，待干镜检太红冲洗时间太长、中性水pH太低、贮存染液质量不佳、涂片干燥前加封片规范操作。新鲜配置中性水。保证染液质量不佳太淡染色时间太短、冲洗时间太长复染。应先加缓冲液，后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液染料沉积染料沉淀、染液未过滤、涂片太脏用甲醇冲洗2次，并立即用水冲掉甲醇，待干后复染蓝色背景固定不当、涂片未固定贮存过久、使用肝素抗凝剂注意涂片的固定。使用EDT
11、A抗凝静脉血实验二、白细胞计数及分类计数原理：用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血红细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内的白细胞数，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。器材：显微镜、改良牛鲍计数板、试管、吸管、微量吸管、滴棒。试剂：白细胞稀释液操作：1、加稀释液 用吸管吸取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。2、吸取血液 用微量吸管吸取新鲜全血或末稍血20ul， 擦去管尖外部余血。将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层白细胞稀释液清洗吸管23次。3、混匀 将试管中血液与稀释液混匀，待细胞悬液完全变为棕褐色。4、充池 再次将小试管中
12、的细胞悬液混匀。用滴棒蘸取细胞悬液1滴，充入改良Neubauer计数板的计数池中，室温静置23min，待白细胞完全下沉。充两个池双份计数取平均值。5、计数 在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。6、计算：白细胞=41020106=20109/L注意事项：1、稀释用吸管、微量吸血管、血红细胞计数板均为计量工具，使用前需经过严格的校正，否则将直接影响计数结果的准确。2、使用标本可为由静脉搏穿刺采取的新鲜全血，也可为静脉末梢血。采集末梢血时，应注意采血部位不得有冻疮、水肿、发绀、炎症等，以免标本失去代表性；同时也应注意不能过度挤压，以免组织液混入引起血液凝因或造成计数结果不准确。3、在充池时，
13、如充液不足、液体外溢、断续充液，或产生气泡、充液后移动盖玻片等，均会使细胞分布不均匀，造成计数结果不准确。4、计数池内的细胞分布应均匀，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过10%，若相差太大，应重新充池。5、计数大小方格内的压线细胞时，遵循数上不数下、数左不数右的原则。6、白细胞数量过多时，可采用加大稀释倍数的方法，注意区分杂质和白细胞。分类计数：原理：将血液制成细胞分布均匀的血涂片，用瑞氏染液染色，根据各类细胞的形态特点和颜色差异将白细胞进行分类并计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占的百分率。器材：显微镜、分类计数器、香柏油、拭镜纸、清洁液。试剂：瑞氏染液、磷酸盐缓冲液操作
14、：1、染色 将血涂片用瑞氏染液染色，冲洗干净，自然干燥后待用。2、低倍镜观察 低倍镜下观察白细胞分布和染色情况。3、油镜观察 选择血涂片体尾交界处细胞分布均匀、着色良好的区域，按一定的方向顺序对所见的每1个白细胞进行分类，并用白细胞分类计数器作好记录，共计数100个白细胞。4、计算 求出各类细胞所占的百分率注意事项：1、由于各种白细胞体积大小不等，体积较小的淋巴细胞在血涂片的头、体部较多，而尾部和两侧以中性粒细胞和单核细胞较多，因此分类最佳区域为体、尾交界处。2、分类时要有秩序地、没一定方向连续地进行，既不重复亦不遗漏，避免主观选择视野。3、分类计数结果的记录也可采用手工画“正”或“+”的方法
15、。实验三、红细胞计数原理：稀释液将血液稀释一定倍数，充入计数池后，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数量，经换算求出每升血液中的红细胞数量。器材：微镜、改良牛鲍记板、试管、微量吸管、玻璃棒。试剂：细胞稀释液操作：1、加稀释液 取小试管1支，加红细胞稀释液2ml。2、加血 用清洁干燥微量吸管采集末稍血或抗凝血10ul擦去管外余血，轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上清液清洗吸管23次，立即混匀。3、充池 混匀后用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放35min，待细胞下沉后于显微镜下计数。4、计数 用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个中方格内的红细胞数。5、计算红细胞/L=N510106200=N1010=100 1012N：表示5个中方格内数得的红细数。 5 ：将五个中方格红细胞数换算成1个大方格红细胞数。10：将1个大方格红细胞数换1ul血液内红细胞数。106：1L=106ul200：为血
