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1、.,1,高效液相色谱（HPLC）,主讲：郝凤霞 能源化工重点实验室,.,2,目 录,基础理论 上机操作前的准备工作 Agillent 1100 的操作 常见故障排除 HPLC在科研中的应用,.,3,一、基础理论,.,4,溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。,1、色谱柱的分离原理,.,5,色谱分析法的分类,按两相的状态分类,.,6,2、分离模式键合相色谱、液液色谱、尺寸排阻色谱,键合相色谱 正相色谱： 流动相极性
2、固定相极性 常规分析，80,.,7,色谱图和峰参数 色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线。 基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。,3、HPLC中的基本概念和术语,.,8,色谱峰(peak)-组
3、分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。 保留时间(retention time，tR)-从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
4、,.,9,流动相的洗脱方式,.,10,等度洗脱,.,11,梯度洗脱,.,12,分析时间长,分离度差,MeOH / H2O = 4 / 6,MeOH / H2O = 8 / 2,等度洗脱,.,13,95%,30%,MeOH 浓度,梯度洗脱,.,14,梯度洗脱是 HPLC 的常用手段,梯度洗脱装置 流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，以调节它的极性，使样品中每个组分都有较高的分离度，从而实现各组分的圆满分离，梯度洗脱可提高柱效，缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于气相色谱的程序升温技术。,.,15,.,16,4、高效液相色谱法的应用范围,高效液
5、相色谱法适于分析沸点高、相对分子质量大，受热易分解的不稳定有机化合物、生物活性物质以及多种天然产物，这些化合物约占全部有机化合物的80%，可应用于化工生产、制药工业、食品工业、生物化工、医学临床检验和环境监测等领域。,.,17,5、HPLC的系统,输液泵 相当于人的心脏，不断提供连续、稳定、精确的流量 进样器 样品引入系统 色谱柱 关键部分，在这里样品实现分离 检测器 对分离后的样品进行检测 数据记录与处理装置,.,18,输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,数据处理系统,HPLC的系统组成,.,19,Agilent 1100 高效液相色谱仪,储液瓶,真空脱气机,混合室,自动进样器,分离柱,
6、VWD,.,20,手动进样,自动进样,.,21,六通阀进样演示,.,22,分离系统色谱柱,功能： 组分分离,目标： 分辨力强 效率高,.,23,吸附剂化学键和固定相色谱柱 化学键合相色谱柱:70% 将不同的官能团通过化学反应键和到硅胶表面的游离羟基上，而形成化学键和固定相，进而形成化学键和相色谱柱。 反相: C18, 65%; C8, 15%; 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。 正相: 20%; -NH2、 -CN 其它 (手性柱， 离子交换柱): 10%,.,24,柱温箱,控制温度，保证分析结果重现性 升高温度，降低了流动相的黏度，降低柱压，保证色谱系统的稳定性,.,25,升
7、温对于反相 HPLC分离强疏水肽的影响 (B27),流动相: A: 含0.05%三氟乙酸的水 B: 含0.05%三氟乙酸的乙腈 2% B / min 进样量: 100L (50g的6M脲/5%乙酸) UV: 210 nm 流速: 1 mL/min 室温,液相色谱柱: C18 色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m,室温 300C 400C 500C 600C 700C,提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）,.,26,检测系统,.,27,药典中的液相检测器,.,28,检测器简介（一）,紫外吸收检测器（UVD） 原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的 变化来测定样品浓度的检测器。
8、它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。 特点：选择性检测器、波长检测范围：190-800nm ； 对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）； 应用最广，对大部分有机化合物有响应； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 定量基础：Lambert-Beer定律，AKbc,.,29,光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,检测器简介（二）,.,30,荧光检测器（fluorescence detector） （FLD） 原理：某些溶质在紫外光激
9、发后能发射可见光（荧光）的性质检测。 特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,检测器简介（三）,.,31,检测器简介（四）, 蒸发光散射检测器（ELSD） 原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。 特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检
10、测器。,.,32,检测器简介（五）, 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。, 示差折光指数检测器（RID） 原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。 特点：通用性检测器，温变化要保持在0.001、灵敏度低（10-6g）,.,33,二、上机操作前，我们需要准备好什么？ 如：样品怎么处理？ 流动相怎么选？ 仪器参数怎么设置？,.,34,1样品的前处理,最好使用流动相溶解样品。 使用预处理除去样品中的强极性或与柱填 料产生不可逆吸附的杂质。
11、使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。,.,35,样品准备,.,36,样品过滤头的类型： 30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2m和0.45m两种规格材料有，纤维素，醋酸纤维，聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。 13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2m和0.45m两种规格。 3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。,.,37,滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，7
12、0%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。,.,38,注意：1：每张滤膜只能用一次。 2：水相和有机相不要搞混。,.,39,.,40,2流动相的配制,流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 流动相的黏度要尽量小 分离效果好 柱压低，延长液体泵的使用寿命 (可运用提高温度的方法降低流动相的黏度),.,41,流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法
13、进行。 在流动相配制好后，一定要进行脱气。,.,42,准备流动相,1) 色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇 水超纯水，18.2Mcm,.,44,过滤装置,.,45,为什么要过滤？,1、对色谱柱、仪器起到保护作用 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 2、消除由于污染对分析结果的影响,.,46,3) 溶剂准备：脱气,.,47,目 的,流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解气体。 以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产
14、生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。 溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。 若用FLD，可能会造成荧光猝灭。,.,48,常用的脱气方法,氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。 在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元
15、溶剂体系。,.,49,3、流动相流速的选择,具体根据色谱柱的内径选择,.,50,4、波长选择,首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。,.,51,5记录时间,第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。,.,52,三、Agilent 1100 机器操作,.,53,1、检查流动相,Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态,.,54,Purge阀,逆时针打开清洗阀,顺时针关闭清洗阀,毛细管出口,流向进样器,废液管,清洗阀打开时溶剂由此流向废液瓶.,.,55,1、检查流动相,Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态 把流动相放入溶剂瓶中，且滤头浸入到液面下 A 水 B 甲醇 C 乙腈 D 缓
