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1、重组DNA技术与基因工程,5,2,3,4,1,6,重组DNA技术与基因工程的基本概念,重组DNA技术所需的基本条件,重组DNA技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母中的表达,A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,5 外源基因在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架,基因克隆表达系统成熟完善,繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定,被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,5 外源基因在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌表达外源基因的劣势,缺乏对真核生物蛋白
2、质的复性功能,缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统,内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白,细胞周质内含有种类繁多的内毒素,B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,5 外源基因在大肠杆菌中的表达,启动子,终止子,核糖体结合位点,密码子,质粒拷贝数,启动子 启动子最佳距离的探测,目的基因,E,E,A,启动子,A 酶切开,Bal31酶解,目的基因,启动子 启动子的筛选,Apr,ori,galK,pKO1,终止密码子,采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段,克隆到启动子探针质粒pKO1上。,受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质,粒上报告基因galk的表达产物联合作用，,可将培养基中的半乳糖
3、酵解成红色素物质,转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株,含有外源启动子活性的重组克隆,启动子 启动子的构建,-35 区序列,-10 区序列,PlL,PrecA,Ptrp,Plac,PtraA,Ptac,启动子,T T G A C A,G A T A C T,T T G A T A,T A T A A T,T T G A C A,T T A A C T,T A G A C A,T A A T G T,T T T A C A,T A T A A T,T T G A C A,T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,启动子 启动子的可控性,P,乳糖启
4、动子Plac的可控性：,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区,Olac偶联在一起，在没有,诱导物存在时，操纵子,基底水平转录,处于基底水平表达；诱,导物可以使启动子Plac介,导的转录大幅提高。,启动子 启动子的可控性,Plac,乳糖启动子Plac的可控性：,O,Plac,O,高效转录,葡萄糖代谢,野生型的Plac上游附近拥有代谢,激活因子（CAP）结合区，小,分子cAMP激活CAP，CAP结,基底水平转录,启动子控制区，进而促进Plac介,导的转录。葡萄糖代谢使cAMP,减少，也能阻遏Plac介导的基因,转录。因此，
5、基因工程中使用,的乳糖启动子均为抗葡萄糖代,谢阻遏的突变型，即Plac UV5。,CAP,cAMP,cAMP浓度降低,Plac UV5,O,高效转录,Ptrp,色氨酸启动子Ptrp的可控性：,Otrp,除去色氨酸,色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏,蛋白复合物的阻遏，转录呈基底,状态。在培养系统中去除色氨酸,基底水平转录,或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），,便可有效地解除阻遏抑制作用。,在正常的细菌培养体系中，除去,色氨酸是困难的，因此基因工程,中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目,基因的表达。,色氨酸,或加3-吲哚丙烯酸,高效转录,阻遏蛋白,（IAA）,Otrp,Ptrp,高效转录,Otrp
6、,Ptrp,启动子 启动子的可控性,l 噬菌体启动子PlL的可控性：,噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻,遏，很难直接诱导控制。在基因,工程中常使用温度敏感型的cI突,变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋,白在42时失活脱落，PL便介导,目的基因的表达。但在大型细菌,培养罐中迅速升温非常困难，因,此常使用一个双质粒控制系统，,用色氨酸间接控制目的基因表达,Ptrp,A,B,cI857,PL,目的基因,阻遏作用,Ptrp,A,B,PL,表达,色氨酸,启动子 启动子的可控性,终止子 强化转录终止的必要性,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录
7、质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。,终止子 强终止子的选择与使用,目前外源
8、基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结,筛选Apr、Tcs的转化子,终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基,构，以增强其转录终止作用。,基因组DNA中克隆筛选。,核糖体结合位点,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位
9、点（RBS），大约涉及30个碱基的长度,大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游10个碱基内的序列 5-UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5端若干密码子的碱基序列；,核糖体结合位点 核糖体结合位点的结构,核糖体结合
10、位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列的影响：,一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S,个换成嘧啶碱基（C或T），均会导致翻译效率大幅度降低。,5 UAAGGAGG 3,5 AGGAGG 3,5 GAGG 3,保 守 程 度 增 强,rRNA的碱基互补性，其中以AGGAGG尤其是GAGG四至六个嘌呤碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四至六个嘌呤碱基中任何一,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列与起始密码子之间的序列的影响：,SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC
11、或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA,或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列与起始密码子之间的距离的影响：,SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均,会导致翻译起始效率不同程度的
12、降低。,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,起始密码子及其后续若干密码子的影响：,大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎,目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与,环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。,启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。,密码子 生物体对密码子的偏爱性,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编
13、码基因，对简并密码,子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：,生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体,fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC,丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子,占90%以上的绝对优势。,密码子与反密码子相互作用的自由能 中等强度规律,细胞内tRNA的含量,如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；,如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；,密码子 生物体对密码子的偏爱性,SD样序列 Gene-Wei Li et al.
14、Nature. 484（7395） 2012,细菌全mRNA范围的核糖体作图发现，在营养丰富的条件下，稀有tRNA所对应的密码子并不导致翻译迟缓。取而代之的是，基因编码区内的SD样序列高频引发核糖体在mRNA上的翻译停顿。这种停顿是由于mRNA与正在翻译着的核糖体上16S rRNA之间的碱基配对造成的。因此，均由嘌呤碱基构成的密码子在原核细菌蛋白质编码基因中是不受欢迎的，如：AGG、GGA、GAG、GGG，尤其是其双密码子组合,翻译启动,翻译停顿,mRNA,密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响,由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程,度的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳
15、动物基因在大肠杆菌中高,效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略,可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：,化学合成外源基因,同步表达相关tRNA编码基因,按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌,外源基因全合成：,密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响,中的高效表达均采用了这种方法。,密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响,对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cD
16、NA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体,同步表达相关tRNA编码基因：,细胞对外源基因高效表达的制约作用。,质粒拷贝数,质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响,目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下
