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1、无菌试验及无菌操作 对灭活前样品无菌试验不合格的分析,目录,1. 无菌试验,2. 无菌操作,3.灭活前样品无菌试验不合格的分析,（一）无菌试验,无菌试验：是无菌的制剂、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种检查方法，同时指出“若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物的污染”。,（一）无菌试验,培养基的制备及培养条件 培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在 2 25 、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。,（一）无菌试验,硫乙醇
2、酸盐流体培养基,酪胨 (胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0 ml 硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g (或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000 ml 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节 pH 值使灭菌后为 7.1 0.2 。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的 1/2 。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的
3、1/5 ，否则，须经 100 水浴加热至粉红色消失（不超过 20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。 硫乙醇酸盐流体培养基置 30 35 培养。 返回,改良马丁培养基,2.改良马丁培养基 胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5g 葡萄糖 20.0g 水 1000 ml 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 值约为 6.8 ，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节 pH 值使灭菌后为 6.4 0.2 ，分装，灭菌。 改良马丁培养基置 23 28 培养。 返回,营养琼脂培养基,胨 10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水 1
4、000 ml 取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入 14.0g 琼脂，调节 pH 值使灭菌后为 7.2 0.2 ，分装，灭菌。 返回,（二）无菌操作,概念,明确基本概念 进行无菌操作时，应首先明确无菌区、非无菌区、无菌物品的概念。 无菌区：指经灭菌处理且未被污染的区域。 非无菌区：指未经灭菌处理，或虽灭菌处理但又被污染的区域。 无菌物品：指通过物理或化学的方法灭菌后保持无菌状态的物品。,环境,操作环境清洁、宽敞 操作环境应清洁、宽敞、定期消毒； 操作台清洁、干燥、平坦、物品布局合理； 无菌操作前半小时应减少走动、避免尘埃飞扬。,人员,工作人员仪表符合规范 无菌操作前
5、，工作人员应戴好帽子和口罩，修剪指甲并洗手，穿好无菌衣、戴无菌手套。,人员,物品,物品放置有序，标志明显 无菌物品必须与非无菌物品分开放置，并且有明显标志。 无菌物品不可暴露于空气中，应存放于无菌包或无菌容器内。 无菌包外需标明物品名称、灭菌日期，并按失效期先后顺序摆放。,操作,无菌操作 进行无菌操作时，操作者身体应于无菌区保持一定距离。 取放无菌物品时，应面向无菌区。 取用无菌物品时应使用无菌持物钳。 手臂应保持在腰部以上，手不可直接接触无菌物品。,操作,非无菌物品应远离无菌区；无菌物品一经取出，即使未用，也不可放回无菌容器内。 避免面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏。 如无菌物品疑有污染或已被污
6、染，应予更换并重新灭菌。,（三）灭活前样品无菌试验不合格的分析,前准备,a）在对灭活罐进行整体CIP前，零部件是否拆卸并进行冲洗。（如温度探头、取样阀） b）灭活罐SIP的过程是否按照SOP执行，灭菌时间是否满足SOP的规定。 C）除菌管道是否按照SOP进行灭菌，灭菌结束应立即与外界隔断，并保证管道内正压。 d）除菌滤材是否按照SOP进行检测、冲洗、灭菌，灭菌结束后是否放置于无菌区域，并关闭所有手动隔膜阀和气嘴，包口不是否完整无破损。 e）除菌滤器连接过程是否按照SOP进行操作，连接过程中，人员、环境是否达到无菌操作的要求。,取样物品,a）取样瓶是否按照SOP要求进行清洁灭菌，瓶口有无破损现象
7、，锡箔纸封口是否完好。 b）塞子铝帽是否按照SOP要求进行清洁灭菌。 c）持物钳是否完好可用并进行消毒。 d）取样物品灭菌后是否摆放在无菌区域。,除菌过程操作,a）除菌过程开始前房间环境的清洁消毒措施是否到位，能否满足洁净室等级要求。 b）除菌过程人员是否按照SOP进行操作，人员进行无菌操作时是否满足无菌操作的要求。 c）在层流罩下进行操作的人员是否按照SOP进行局部消毒。 d）操作过程所使用的设备设施是否异常。 e）操作人员是否定期进行局部消毒。,取样环节,a）取样物品是否按照SOP进行清洗灭菌，灭菌后的物品是否按照规定存放于无菌区域。 b）取样操作前，取样阀是否进行SIP，并在使用周期内；操作人员是否进局部消毒，局部的取样环境无关人员不得靠近。 c）取样过程是否按照SOP进行操作，整体操作能否满足无菌操作的要求。 d）样品所接触位置（瓶口、塞子）手部不能直接触碰，应当用灭菌的持物钳接触。,Thank You !,知识回顾Knowledge Review,祝您成功！,
