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1、Western Blot 实验操作指南 Western Blot 即蛋白质印迹法（免疫印迹试验） ，是分子生物学、生物化学和免疫遗 传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生 物组织样品中的特定蛋白进行显影。通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所 分析的细胞或组织中表达情况的信息。 实验流程 主要包括以下几个步骤： 样品制备；SDS-PAGE 凝胶电泳；转膜；封闭；免疫杂交；显影。 实验器材 操作步骤 样品制备 准备进行 western blot 的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。样品 为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞、组
2、织或包埋组织等则需要根据样品的特性 对其进行提取。根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。 （1）以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取： 1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使 残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走） 。 2、 每瓶细胞加 3ml 4预冷的 PBS（0.01M pH7.27.3） 。平放轻轻摇动 1min 洗涤细 胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培 养瓶置于冰上。 3、 按 1ml 裂解液加 10 l PMSF（100mM） ，摇匀置于冰上。 （PMSF 要摇匀至无结晶
3、 时才可与裂解液混合。 ） 4、 每瓶细胞加 400 l 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30min，为使细胞充分裂解培养 瓶要经常来回摇动。 5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快） ，然后用枪将细胞碎 片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。 （整个操作尽量在冰上进行。 ） 6、 于 4下 12000rpm 离心 5min。 （提前开离心机预冷） 7、 将离心后的上清分装转移倒 0.5min 的离心管中放于20保存。 （2）以哺乳动物组织样本为例，对其进行总蛋白提取： 1. 将 100 mg 组织剪切成小块，加入适量的冰冷 PBS 洗涤两次后，4，700g（3000
4、 rpm) 离心 3 min，弃上清。20mg 组织加入 100l 裂解液，置玻璃匀浆器冰上均质 30 50 次。(如使用组织匀浆机，则按照 20 mg 组织加入 100 l 裂解液的比例加入裂解液。 每个试管加入 2 个直径 2 mm 的磁珠。将试管放入组织匀浆机中，60 HZ，300s。充分裂 解后，10000 g 离心 5 min，取上清。) 2. 最大速度涡旋震荡 10sec，冰上放置 20 min，期间取出震荡 3-5 次,再于 4， 12000 rpm 离心 10 min，以沉淀组织或细胞碎片，取上清。 生工相关产品： 产品编号 产品名称 产品编号 产品名称 C510001 细胞核
5、蛋白/浆蛋 白抽提试剂盒 C500005、 C510006、 C500007、 C500008 RIPA 裂解液 IIV C510002 膜蛋白、核蛋白和 胞质蛋白抽提试剂 盒 C510003 动物全蛋白提取试 剂盒 C510005 膜蛋白和胞质蛋白 提取试剂盒 C500058 石蜡包埋组织蛋白 提取试剂盒 C500009 细胞核蛋白质提取 试剂盒 C500049 膜蛋白提取试剂盒 C500051 胞质和线粒体蛋白 质提取试剂盒 C500073 亚细胞结构蛋白提 取试剂盒 C500053 植物蛋白提取试剂 盒 C510020 一步法昆虫细胞活 性蛋白提取试剂盒 C510004 一步法植物活性蛋
6、 白质提取试剂盒 C500023 一步法细菌活性蛋 白提取试剂盒 C500006 一步法动物组织活 性蛋白提取试剂盒 C500026 一步法酵母活性蛋 白提取试剂盒 C500022 一步法动物细胞活 性蛋白提取试剂盒 蛋白定量 蛋白定量是做 WB 实验的基础。 蛋白定量的目的是：保证同一组中的不同样本的蛋白总量保持一致，只有这样，wb 结果的 内参、灰度等数据才可信。否则实验数据没有参考价值。 蛋白定量的方法很多，常用的有 Lowry 法、BCA 法、紫外吸收法、Biuret 法、这些方法各 有优缺点。应该按照具体实验选择不同的实验方法进行蛋白定量。 示例：BCA 法蛋白定量 1. 根据样品数
7、量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B(50:1)配制适量 BCA 工作 液，充分混匀。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。 2. 完全溶解蛋白标准品，取 10ul 稀释至 100ul，使终浓度为 0.5mg/ml。蛋白样品在什么 溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀 释标准品。 3. 将标准品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul 加到 96 孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的 溶液补足到 20ul。 4. 加适当体积样品到 96 孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液至 20ul
8、。 5. 各孔加入 200ulBCA 工作液，37放置 30 分钟。 注: 也可以室温放置 2 小时，或 60放置 30 分钟。BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随 着时间的延长不断加深。并且显影反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温 度孵育，或延长孵育时间。 6. 测定 A562，540-595nm 之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 凝胶电泳 Western blot 通常使用 SDS-PAGE 进行电泳。 根据自身蛋白的分子量选择 SDS-PAGE 的浓度， 如蛋白分子量未知可以选择梯度凝胶。 可以选择自制聚丙烯酰胺凝胶或购买预制胶。 以 SDS-PAGE10%
9、自制胶为例，准备进行凝胶电泳： 1. 根据蛋白的分子量确定好 SDS-PAGE 胶的浓度，装配好灌胶的模具。 2. 进行分离胶的配置，取一个烧杯，按照配方加入适量的聚丙烯酰胺溶液，10%SDS，分离 胶缓冲液，混匀。加入适量的过硫酸铵和 TEMED，轻轻搅拌（注：不要产生气泡） ，将此液 体缓慢加入到模具内。 3. 加入分离胶后轻轻在分离胶溶液上覆盖上水。 4. 等待 3060min，待凝胶聚合后，分离胶和水层出现一个清晰的界面，吸尽分离胶上的 水。 5. 进行浓缩胶的配置，取一个烧杯，按照配方加入适量的聚丙烯酰胺溶液，10%SDS，浓缩 胶缓冲液， 混匀。 按照配方加入适量的过硫酸铵和 TE
10、MED， 轻轻搅拌 （注： 不要产生气泡） ， 将此液体缓慢加入到分离胶的上面，直至灌满，将梳子插入凝胶内（保证梳子齿末端没有气 泡） 。 6. 等待 30min 左右，待凝胶聚合后小心拔出梳子，将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并 组装好。 7. 将电泳缓冲液加入内外槽中，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲中。 8. 将制备好的样品与上样缓冲液按比例混合，95100加热 35min，取 15ul(可根据 试验情况进行调整)将样品加入到凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白 marker 作为参照。 9. 接通电源进行电泳，观察 marker，待 maker 显示的目标蛋白与其他蛋白明显分离
11、停止 电泳， 一般情况下是等溴酚蓝标记的样本跑出凝胶， 目标蛋白的分子量不同电泳停止的时间 不同，视实验而定。 生工相关产品： 产品编号 产品名称 产品编号 产品名称 C631100 SDS-PAGE 变性丙 烯酰胺凝胶快速制 备试剂盒 C621100 Precast-GL 预 制 胶 7.5% 10 孔（用 于变性电泳） C621101 Precast-GL 预 制 胶 10% 10 孔（用 于变性电泳） C621102 Precast-GL 预 制 胶 12% 10 孔（用 于变性电泳） C621103 Precast-GL 预制胶 15% 10 孔 （用于变性电泳） C621104 Pr
12、ecast-GL 预 制 胶 415% 10 孔 （用于变性电泳） C621105 Precast-GL 预 制 胶 420% 10 孔 （用于变性电泳） C508320 5 x 蛋白质加样缓 冲液 C506023 10 x Tris-Glycine Gel Running Buffer C610011 TureColor 双色预 染蛋白 Marker C600525 蛋白非预染 Marker IV，中分子 量范围 C600524 蛋白非预染 Marker III，中分 子量范围 转膜 转膜是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上的过程。转膜的方法可分为半干转和湿 转，湿转法转膜效率较高，使用转膜
13、液多，转膜时需要冷却，半干转转膜时间短，需要的 转膜液少，不适合转移高分子量蛋白质。 膜可以选择 PVDF 膜和 NC 膜。PVDF 膜与目的蛋白结合能力较高，灵敏度高，不易 破碎，可适用于再次标记（使用前需要浸泡在甲醇中激活） 。NC 膜不需要甲醇激活但易破 碎。膜的规格有 0.45m 和 0.2m 两个规格，大于 20kd 的蛋白可用 0.45m 的膜，小于 20kd 的蛋白要用 0.2m 的膜。 NC 膜 尼龙膜 PVDF 膜 灵敏度和分辨率 高 高 高 背景 低 较高 低 结合能力 80110 ug/cm2 400 ug/cm2 125200 ug/cm2（适 合于 SDS 存在下与蛋
14、白 质的结合） 材料质地 干的 NC 膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有 操作程序 缓冲液润湿,避免气泡 缓冲液润湿 使用前 100%甲醇润湿 适用范围 0.45um 一般蛋白 0.2um 一分子量小于 20kD 蛋白 0.1um 一分子量小于 7kD 蛋白 低浓度小分子蛋白、 酸性蛋白、糖蛋白和 蛋白多糖(主要用在 核酸检测中) 糖蛋白检测和蛋白质测 序 价格 价格较便宜 便宜 较贵 以 PVDF 膜，湿转为例（仅供参考） ： 1. 准备好转膜液，将胶浸于转膜缓冲液 10min 左右。 2. 根据胶的大小剪 PVDF 膜（使用前需要用甲醇处理）和滤纸，放到转膜缓冲液中平衡
15、10min 左右。 3. 装配转膜，在海绵上放置 3 层已经用转膜液浸泡过的滤纸，放置胶，放置处理好的 PVDF 膜，放置 3 层已经用转膜液浸泡过的滤纸，放置海绵，注意每层之间都不能有气 泡，用转膜仪中的支架夹住。 （胶位于负极） 4. 将转膜“三明治”放置到转膜槽中，加转膜缓冲液，将转移槽置于冰浴中。插上电极， 根据蛋白分子量确认转膜的电压/电流，时间。 5. 转膜结束后，切断电源，取出 PVDF 膜。 注：转膜后可能分不清膜的方向，可在膜上剪角，有利于判断膜的方向。 生工相关产品： 产品编号 产品名称 产品编号 产品名称 C520003 10X 印迹膜专印缓 冲液 C506044 1X
16、Tris-CAPS 印 迹膜转印缓冲液 C520039 10X 高分子量印迹 膜转印缓冲液 C620393 Western Blot 试剂 盒（兔） ，带 PVDF 膜 C610393 Western Blot 试剂 盒（大鼠） ，带 PVDF 膜 C600393 Western Blot 试剂 盒（小鼠） ，带 PVDF 膜 C520005 丽春红染色溶液， 5 X 封闭及免疫杂交 为了防止抗体和膜非特异性的结合，加入封闭试剂将其他未结合蛋白的区域进行封闭。 封闭的操作步骤（仅供参考） ： 1. 用适量的 TBS/PBS 洗已经转好的膜，室温，放到摇床上晃动。 2. 将膜置于约 25ml 封闭缓冲液中 1h，室温，置于摇床上晃动。 3
