《(2020年){生产管理知识}生产用种细胞鉴定的相关》由会员分享，可在线阅读，更多相关《(2020年){生产管理知识}生产用种细胞鉴定的相关（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生产管理知识生产用种细胞鉴定的相关支原体液体培养基的颜色变化来判定阳性不够严谨，因为假阳性的可能性较大。按照规程上的标准检测方法是要通过固体培养基培养获得典型菌落并鉴别才能确切判定，而质检和产品技术部目前在这一检测方面，液体培养基的检测技术比较成熟，其缺陷在于存在的假阳性或假阴性的可能性较大，根据国际通行的标准，必须根据标准程序中的固体培养基中培养出支原体菌落才能最终定论，而我公司在固体培养基的支原体检测技术方面不太成熟。细胞系鉴定和检测的一般原则：对建系细胞基质的鉴定和检测是生物技术产品及生物制品质量控制的重要组成部分。通过对主细胞库的鉴定，可对是否存在来自其他细胞系的细胞、外来和内在因子以
2、及其他污染物(如来自于宿主的毒素或抗生素)进行评估。检测的目的是为了证实用于生产的细胞基质的特性、纯度和可用性。在有些情况下，其他方面如致癌性或胞核学的检测也是有用的。对某一细胞基质选择何种检测方案要根据细胞的生物学特性(如生长的需求)、它的培养历史(如人源和动物源性的生物试剂的使用)和可应用的试验方法而定。细胞基质的鉴定程度将影响以后的生产阶段所需的常规试验的类型或水平。生产厂家应对每个主细胞库作一次纯度试验和鉴别实验，对将要注册的每一产品在细胞培养期间作一次稳定性试验。此外，还要对每一个工作细胞库作纯度和有限的鉴别试验,而我们在这一块存在检测漏洞,故在此对相关检测技术进行开展和完善.3、目
3、的与意义对细胞系鉴定和检测一般从鉴别试验、纯度试验、稳定性试验、胞核学和致瘤性试验来开展和完善，本试验致力于开展各种细胞鉴定和检测的相关方法和技术，具体重点学习与掌握细胞的支原体、外源病毒污染检测、核型分析等技术。有利于整理手上现有细胞资源，建立完善生产用种细胞库，对细胞用于生产的可适性进行掌握，以满足生产需求，为保证生产、提高产品质量奠定基础。4、实验方案4、1方案一支原体培养基的配制及其检测实验4.1.1实验目的寻找一种方便实用、检出率高的支原体培养基，并能运用其检测生产用种细胞是否受支原体污染，以能观测到典型支原体菌落为阳性判定标准。4.1.2实验人员：实验时间：9月1日12月30日4.
4、1.3实验方法4.1.3.1检测方法一直接购买猪鼻支原体合成培养基按其使用方法进行检测4.1.3.2检测方法二按照中华人民共和国兽用生物制品规程进行检测4.1.3.2.1材料与器材材料:猪鼻支原体菌种、制备培养基相关药品器材:小试管、长吸管、锥形瓶、玻璃棒、天平、量筒、烧杯、平皿、正压不锈钢滤器、除菌滤膜、高压灭菌锅、pH计、显微镜、移液枪、二氧化碳培养箱4.1.3.2.2培养基的制备液体培养基PPLO肉汤粉21g葡萄糖5g10%精氨酸溶液10ml1%醋酸铊溶液10ml25%酵母浸出液100ml10倍MEM10ml8万单位/ml青霉素溶液10ml猪（马）血清100ml1%酚红溶液1ml双蒸水加
5、至1000ml用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.8，过滤除菌，定量分装，置-20保存备用。固体培养基PPLO肉汤粉21g葡萄糖5g1%醋酸铊溶液10ml25%酵母浸出液100ml琼脂粉15双蒸水加至1000ml上述成分混合后加热溶解，定量分装，116高压灭菌20min，置2-8保存备用。添加成分固体培养基100ml血清10ml8万单位/ml青霉素溶液1ml10%精氨酸溶液2ml10倍MEM1ml使用前将琼脂培养基加热溶解，当温度降到60左右添加辅助成分。4.1.3.2.3检测方法液体培养基培养取待检样5ml，接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中取0.2ml移植接种于一小管液体培养基中，将小瓶
6、与小管放37培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变化，若无变化，则在最后一次移植小管观察14日后，停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，在原pH值变化达0.5时，应立即移植于小管液体培养基和固体培养基，观察液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的煎蛋状支原体菌落。固体培养基培养在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1ml到0.2ml接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳潮湿的环境、37培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原值变化达0.5时也同时接种琼脂平板
7、。每5-7日，在低倍显微镜下观察，检查各琼脂平板有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落者停止观察。每次检查时需设阴、阳性对照，在同条件下培养观察。结果判定被接种物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落，判阳性。若阳性对照中至少一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。备用检测方法一1.配方KM2液体培养基EaglesMEM450mLL1醋酸铊125mlML酵母浸出粉10gL04酚红175mLL用1molL的NaOH调pH7678，分装，高压灭菌(121)15min，然后置4保存。使用前加青霉素20万单位L、3谷氨酰胺10mLL、灭菌健康猪血清200mL/L2.方法2.1培养
8、取05mL菌液，加入含45mLKM2液体培养基的小瓶中，37培养。每日观察其颜色变化，并与阴性对照进行比较。每3天传代1次，3-4代后，离心(15000rrain)收集菌体，悬浮于02molL的PBS缓冲液中。2.2姬姆萨氏染色法取灭菌洁净载玻片，滴加菌体悬浮液2滴，自然干燥后，经甲醇固定，然后用姬姆萨氏染色法染色30mJn，水漂洗干燥后，100X倍显微镜下观察。3.鉴定试验3.1染色镜检挑取传代的单菌落液体培养物，分别用瑞士染色和革兰氏染色，油镜镜检。3.2普通培养基生长将传代的单菌落液体培养基接种普通肉汤琼酯板，湿盒37培养。3.3兔血培养基生长无菌采鲜兔血制成兔血琼酯板，同样接种传代的单
9、菌落液体培养物，湿盒37培养3.4吸附红细胞在指数生长期的选择培养基琼酯板上缓缓加入025的兔向红细胞悬液，作用20rnin，用生理盐水洗涤23次。3.5生化试验用传代的单菌落液体培养物接种尿素、七叶苷、甘露糖、精氨酸双水解、葡萄糖细菌微量发酵生化鉴定管(北京路桥技术有限责任公司)，37培养。备用检测方法二1.配方一种高效支原体培养基基础培养基：蛋白胨9.0-11.0新鲜牛肉提取纯粉氯化钠磷酸二氢钾蒸馏水液体培养基内还加有：新生牛血清新鲜酵母浸液尿素溶液或精氨酸溶液酚红溶液青霉素固体培养基内还加有：琼脂2.方法略备用检测方法三1、 配方：（1）支原体肉汤培养基成分加量猪胃消化液500ml牛肉浸
10、（粉）液500ml酵母浸液5.0g氯化钠2.5g葡萄糖5.0g酚红0.02g将上述成分混合溶解，分装于玻璃管中，每支8ml，于121高压灭菌15min备用。（2）支原体半流体培养基：将（1）中酚红去掉，加入3g琼脂即为半固体培养基。（3）支原体琼脂培养基：将（1）中酚红去掉，加入13.0-15.0g琼脂即可。2、 检查操作方法：（1）按药典要求，检查支原体采用支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基（或支原体固体培养基），每个样品准备上述培养基各10支。（2）操作程序a.配制12.5万单位/青霉素及1.2%浓度的醋酸铊储备液，用0.22ul除菌滤膜滤后备用b.将支原体半流体培养基或固体培养基在使用
11、前煮沸10-15min完全融化，冷却至56左右备用。c.按无支原体灭活小牛血清：12.5万单位/ml青霉素=20：1的比例混合（若是分离原体用，可按无支原体灭活小牛血清：1.2%醋酸铊：12.5万单位/ml青霉素=20：2：1），加入到支原体肉汤培养基及56左右支原体半流体培养基或固体培养基中（牛血清、醋酸铊青霉素的使用终浓度分别为17%、0.1%、2000U/ml)每支2.0ml.d.将待检cell加入到上述准备好培养基中，每份样品接种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基（固体培养基）各4支，每支接种0.5-1.0ml,置（360.5）培养21天，每三天观察一次，留两支对照同等条件下培养。e
12、.于接种后第7天取出上述4支接种样品培养基中的2支进行传代培养（另2支继续培养），每支接种半流体培养基和液体培养基（或固体培养基）各2支，每只接种1.0ml,置（360.5）培养21天，每三天观察一次。（3）结果判定a.试验成立。培养基对照阴性，试验成立，结果有效。b.阴性。试验到期接种样品的初种及转种培养基（每支培养基共8支）均无支原体生长。c.复试。如疑有支原体生长，应取加倍量供试品在上述2种培养基上进行复试（每支接种待测样品1.0-2.0ml)经复试后无支原体生长则判合格。d.阳性。试验到期接种供试品的初种或转种培养基有支原体生长或结果可疑经复试后仍有支原体生长，则为阳性结果，判定供试品
13、被支原体污染。支原体在半固体培养基的典型菌落如“彗星”状。备用检测方法四1、 配方（1）液体培养基1LPPLO肉汤粉21g酚红0.02g马血清200ml15%酵母浸出液100ml10MEN培养液100ml称取21gPPLO肉汤粉、0.02g酚红于600ml蒸馏水中加热搅拌溶解，12115min灭菌，待温度降至室温后，于净化工作台中加入200ml马血清100ml15%酵母浸出液，100ml解冻10MEN培养液，混匀分装至无菌有盖螺旋试管10ml/管，保存4一个月。（2）固体培养基1LPPLO肉汤粉21g酚红0.02g细菌琼脂15g蒸馏水600ml马血清200ml15%酵母浸出液100ml10原液
14、100ml称取21gPPLO肉汤粉、0.02g酚红，15g细菌琼脂于600ml蒸馏水中加热溶解，12115min灭菌，放入50水浴待温度降至50时于无菌操作台中加200ml马血清，100ml15%酵母浸出液及100ml解冻的10原液，混匀后倒入培养皿中5ml/培养皿，4，1个月。2、 操作步骤（1）取1mlcell培养液或0.2mlcell悬液接种于液体培养基中37培养2周，观察是否浑浊或PH是否改变，1-2周后分别取0.1ml液体培养液涂在固体培养基上，倒放置于37厌氧缸培养至少3周，持续观察有无菌落出现。（2）另取取1mlcell培养液或0.2mlcell悬液涂抹于固体培养基上37厌氧培养
15、3周，持续观察有无菌落出现。（3）另做正负反应对照组，负反应组为待测cell的新鲜培养基。4、2方案二细胞核型分析4、2、1目的与意义在部分灭活疫苗的生产中使用细胞系,将特定的细胞系用于疫苗生产前,必须对细胞进行全面的鉴定,其中细胞的核型分析是鉴定的重要组成部分,因核型能反映物种的种质特性,是再现性很高的细胞遗传学信息,为物种所特有。本实验对生产猪细小病毒灭活苗的IBRS-2细胞不同代次的染色体核型进行比较分析，以确定生产该病毒细胞的最高限制代次。成功的进行了该细胞的核型分析，将意味着掌握这一检测技术，实现对生产用细胞进行代次使用情况的监控与把握。4、2、2实验时间：10月1日10月31日实验人员:4.2.3试验材料细胞:试验所使用的IBRS-2原始细胞来源于生产细胞库，基础细
