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1、实验五淋巴细胞分离与E玫 瑰花环形成实验,实验目的,熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法 学习E花环试验的操作方法 观察显微镜下E花环的形态,实验原理,淋巴细胞成功分离后，便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还可以用于E花环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培养（需无菌操作）。 淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低。无论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应有活性。,实验原理,分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。,实验原理,本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根
2、据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.0740.001），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。,实验原理,人 T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花环试验(erythrocyte-roseette formation test)。 该试验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。,实验原理,T细胞,SR
3、BC,E受体（CD2),实验器材,注射器、刻度吸管、毛细吸管、玻片、试管、离心管 肝素、无Ca、Mg的Hanks液、淋巴细胞分离液、双蒸水、生理盐水、 0.8%戊二醛、瑞氏染液 绵羊红细胞悬液 （鸡红细胞悬液）、 离心机、水浴箱、显微镜等。,实验步骤,1.取1ml豚鼠肝素抗凝血于试管中，加等量Hanks液稀释，手动轻轻摇匀； 2.取2ml淋巴细胞分离液加入15 ml离心管中； 3.用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢加入，注意保持两种液体界面清晰 4.室温下立即置水平式离心机以2000rpm 离心20分钟，离心后分为4层。 5.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处单个核细胞（PBMC）
4、层至一刻度离心管内。 6.加入5倍以上体积的Hanks液洗涤3次，每次以2000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀主要为单个核细胞） 。,豚鼠背足静脉取血,一人抓住豚鼠，将其左或右后肢膝关节伸直； 另一人消毒豚鼠的脚背面并找出背中足静脉，以左手的拇指和食指拉住其趾端； 右手持注射器刺入静脉，徐徐抽取血液，达所需量时，拔出针头，用无菌棉球压迫止血。,稀释的血液,分离液,离心,稀释的血液,分离液,外周血单个核细胞（PBMC）主要指T、B淋巴细胞、NK细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，PBMC的分离也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要中间环节。,实验步骤,5.取一定量的兔血于离心管中，用无
5、Ca、Mg的Hanks液洗涤3次，每次离心1500 rpm5min。将压积RBC配制成1%红细胞悬液。 6.取0.1ml淋巴细胞悬液，加入等量1RBC悬液和0.1ml小牛血清混匀，37水浴15min， 500rpm离心5min，取出.（直接取样，滴加事先滴有美兰染液的载玻片上，计数早期RE花环） 7.置于4冰箱20min，小心吸去上清，沿管壁加12滴0.8%戊二醛，轻轻转动试管小心混匀。 8.置于4冰箱15min，取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，镜下观察。,实验结果,计数花环个数，结合3个以上的SRBC为一个花环，计算活性E花环形成率，正常值为50%-80%。 E花环形成率 形成花结的淋巴细胞数 /淋巴细胞总数 （形成花结+未形成花结）100%,分析讨论,1.你的实验结果怎样？请加以分析。 2.能否用涂片法来观察RE花环形成情况？为什么？,
