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1、生化药物生产项目报告书1.资料查找1.1核酸相关知识1.1.1核酸简介由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。在一定理化因素作用下，核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂，变成单链的现象称为变性。引起核酸变性的常见理化因素有加热、酸、碱、尿素和甲酰胺等。变性DNA在适当条件下，可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为复性1.1.2种类核酸同蛋白质一样，也是生物大分子。核酸的相对分子质量很大，一般是几十万至几百万。核酸水解后得到许多核苷酸
2、，实验证明，核苷酸是组成核酸的基本单位，机组成核酸分子的单体。一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基（称碱基）、一分子五碳糖（即五碳糖）和一分子磷酸组成的。根据五碳糖的不同可以将核苷酸分为脱氧核糖核苷酸（DNA）和核糖核苷酸（RNA）。DNA存在多级结构l DNA的一级结构即由核苷酸聚合而成的生物大分子。l DNA二级结构即双螺旋结构（doublehelixstructure）。l DNA三级结构是指DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构。l DNA的四级结构DNA与蛋白质形成复合物1.1.3作用核酸在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成
3、上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转运核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。A.积极作用核酸在实践应用方面有极重要的作用，现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。如人类镰刀形红血细胞贫血症是由于患者的血红蛋白分子中一个氨基酸的遗传密码发生了改变，白化病患者则是DNA分子上缺乏产生促黑色素生成的酪氨酸酶的基因所致。肿瘤的发生、病毒的
4、感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。70年代以来兴起的遗传工程，使人们可用人工方法改组DNA，从而有可能创造出新型的生物品种。如应用遗传工程方法已能使大肠杆菌产生胰岛素、干扰素等珍贵的生化药物。核酸氧化分解后变成了磷酸和碱基的嘌呤和嘧啶，目前还没有发现嘧啶有何害处，但嘌呤是导致人类尿酸增高和痛风的主要原因。B.消极作用核酸氧化分解-生成嘌呤-嘌呤在肝脏进一步氧化成为（2，6，8-三氧嘌呤）又称为尿酸，尿酸盐沉积到关节腔等组织引起痛风发作。因此，核酸不是越多越好，同时，这也说明了为什么中老年易患痛风，因为年纪来了，大量的细胞死亡，而细胞内有大量的核酸，生成嘌呤，再生成尿酸，从而导致痛风发作。防
5、治好痛风就是要防止核酸被氧化。1.1.4核酸的组成核酸同蛋白质一样，也是生物大分子。核酸的相对分子质量很大，一般是几十万至几百万。核酸由C、H、O、N、P，5种元素组成。核苷酸是组成核酸的基本单位，是组成核酸分子的单体，核酸是核苷酸通过3，5磷酸二酯键连接的。单个核苷酸是由含氮有机碱（称碱基）、戊糖（即五碳糖）和磷酸三部分构成的。碱基：构成核苷酸的碱基分为嘌呤和嘧啶二类。嘌呤主要指腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G），DNA和RNA中均含有这二种碱基。嘧啶主要指胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U），胞嘧啶（C）为DNA和RNA共有，而胸腺嘧啶（T）只存在于DNA中，尿嘧啶（U）则只存在于RNA中。1
6、.1.5DNA与RNA的区别核酸DNARNA名称脱氧核糖核酸核糖核酸结构规则的双螺旋结构通常呈单链结构基本单位脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸五碳糖脱氧核糖核糖含氮碱基A（腺嘌呤）A（腺嘌呤）G（鸟嘌呤）G（鸟嘌呤）C（胞嘧啶）C（胞嘧啶）T（胸腺嘧啶）U（尿嘧啶）分布主要存在于细胞核，少量存在于线粒体和叶绿体主要存在于细胞质功能绝大多数生物的遗传物质，携带遗传信息，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用作为遗传物质：只在RNA病毒中；不作为遗传物质：在DNA控制蛋白质合成过程中起作用。mRNA是蛋白质是合成的直接模板、tRNA能携带特定氨基酸、rRNA是核糖体的组成成分；催化作用
7、：酶的一种1.2核酸的制备核酸几乎存在所有生物的细胞中，所以制备的原料多种多样，采用的生物材料不同，制备的方法也会有所不同，但基本原理都是一样的。首先破碎细胞，释放细胞内容物，即释放出核酸，常见的破碎细胞的方法有组织粉碎机、研钵、超声波、酶处理、冻融法；然后除杂，应该清除的杂质主要包括三部分（1）非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类物质等（2）非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子时，其它的核酸分子皆为杂质；（3）加入的有机溶剂和某些金属离子最后分理出核酸，当然分离出核酸后，还可以进一步纯化。沉淀是分离核酸的最常用的方法常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁；常用的有
8、机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇，我们通常采用乙醇沉淀核酸。核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除1.3核酸的检测1.3.1定性检测RNA和DNA的显色D核糖核酸浓盐酸地衣酚反应显绿色D2脱氧核糖核酸酸二苯胺反应显蓝紫色1.3.2DNA的定量和纯度测定常用的测定方法有：紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个吸光度值相当于50gmL双螺旋DNA；除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测，A260A280比值，纯的DNA为18，RNA为20，样品中含有蛋白质和苯酚时，A26A280比值降低。）定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地
9、衣酚显色法）；定磷法（测定核酸的磷酸部分）。这里着重二苯胺显色紫外分光光度法（1）原理DNA在酸性条件下其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成羟基酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在40400g范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。（2）DNA吸光度的测定A260测定：以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释倍数，使A260值在20左右（DNA此时的浓度约为100gmL。（由于二苯胺法的测定范围是40400gmLDNA，所以DNA浓度如
10、果太小会影响测定结果）。A280测定：A260A280比值计算。纯的DNA为18，RNA为20。如果样品中混有RNA，则比值大于18；如果样品中混有蛋白质，则比值小于18。所用的DNA溶液为前面提取后溶解的DNA样品。（3）DNA标准曲线的制作和样品测定加完各试剂后，充分混匀。于60水浴中保温1h，冷却后于595nm波长处以0管为空白调零，测定各管光密度（OD595）。以DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。（注：待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。）（4）DNA含量计算以样品的光密度，根据标准曲线计算出相对应D
11、NA含量，并同紫外法测定的值进行比较。（注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色，操作中应防止洒出；比色时，比色杯外面一定要擦干净。）2.方案制定2.1核酸的制备（1）实验原理在溶解细胞，核蛋白释放后，根据DNA不溶于0.14mol/LNaCl溶液而RNA可溶的特性将DNA核蛋白与RNA核蛋白分离，得到粗品。粗品中主要成分为DNA和蛋白质，用氯仿、异戊醇进行抽提，可除去其中的蛋白质。再加入一定量的异丙醇或乙醇，较长的基因组DNA分子将形成纤维状絮团漂浮其中，而质粒或细胞器中的小分子DNA则只能形成颗粒状沉淀物附着在容器壁或底部，用玻棒挑出纤维状絮团即可达到比较满意的分离效果，得
12、到纯度较高的基因组DNA。上清液中的RNA同样也可以采用相同的方法提取，先用氯仿、异戊醇除去其中的蛋白质，再加入异戊醇或乙醇离心得到RNA沉淀。（2）实验原料、试剂、器材与仪器实验原料：新鲜猪肝实验试剂：95%乙醇、氯仿、异戊醇，固体氯化钠等器材与仪器：可见光光度计、紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、离心管等。（3）操作步骤 取新鲜猪肝少许，剪碎后洗去血水，加入2倍组织重的0.14mol/LNaCl-0.5mol/L柠檬酸混合液，用组织粉碎机粉碎，制得匀浆 取10ml匀浆装入离心管，平衡后于3500r/min离心15min，保留上层RNA提取液留着备用； 在沉淀加
13、入1mol/LNaCl，再次于3500r/min离心10min； 取上清液，加入氯仿和少许异戊醇3500r/min离心10min，得到蛋白质沉淀，除去蛋白质 取上清液加1到2倍体积的95%乙醇搅拌，得到DNA沉淀 在保留的上层RNA提取液中，加入氯仿和少量异戊醇，充分振荡，然后3500r/min离心10min,得到蛋白质沉淀 取上清液，加入1到2倍体积95%乙醇，离心，可得到RNA沉淀2.2核酸的检测（1）RNA的鉴定，地衣酚显色法RNA与地衣酚会发生显色反应，溶液变为绿色，且颜色越深，说明RNA含量越多。将RNA沉淀用2mL蒸馏水溶解，然后转移至2只试管中，每只1mL。其中一只试管中加入3m
14、L地衣酚试剂，然后置沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加入2mL二苯胺试剂，60条件下反应1h，观察颜色反应。（2）DNA的鉴定，二苯胺显色法DNA会与二苯酚发生显色反应，溶液会变成蓝色，且颜色越深说明DNA含量越多。在DNA沉淀中加入1mol/LNaCl溶液或者蒸馏水溶解沉淀。各取上述1mLDNA溶液于两只试管中，其中一只里面加入3mL地衣酚试剂，然后置沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加入2mL二苯胺试剂，60条件下反应1h，观察颜色反应。3.PPT展示1.资料查找1.1SOD的基础知识1.1.1简介超氧化物歧化酶，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD是一种源
15、于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。它在生物界的分布极广,几乎从人到细胞,从动物到植物,都有它的存在。1.1.2对人体的作用炎症过程中产生的过氧化物游离基可造成机体的损害，SOD能促使过氧化物游离基转化成过氧化氢和氧具有而有强大的抗炎作用。O2具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老，SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除自由基O2。（1）抑制心脑血管疾病机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD可清除人体内过多的有害的氧自
