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1、多肽抗原的设计与抗体制备,第二版,多肽抗原的设计 多肽的固相合成和纯化 多肽的交联和免疫 抗多肽抗体的检测和功能学鉴定 抗体的纯化 怎样利用Internet 的免费资源寻找与抗体相关的信息,抗合成肽类抗体制备程序,免疫原性肽的选择,肽的合成、纯化与鉴定,载体蛋白的选择,连接剂的选择,载体蛋白/肽连接物,免疫动物,McAb的制备,ELISA筛选抗体血清反应性,收集阳性血清,Western blot, Immunofluorescence assay 鉴定抗体的生物学功能,阳性抗体的纯化,免疫原性肽选择的基本程序,利用在线设计软件或DNAStar筛选抗原性强的多肽序列,尽量使用N端或C端的序列,该
2、序列经Blast后在人的其他蛋白中同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高度保守,用peptide companion 软件判定易于合成的14-16个氨基酸,免疫原性肽选择的注意事项,避开信号肽，磷酸化，糖基化位点 避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如zinc finger，SH2 domains ，GTP binding sites 。 有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。 如果选用MBS交联方法，需要在N端或C端加上C 对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcript variants ），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多肽,利用Swiss-Pr
3、ot数据库辅助设计,.UniProtKB-Swiss-Prot entry P26992 CNTFR_HUMAN Ciliary neurotrophic factor receptor alpha.htm,多肽的固相合成,此法的基本过程是：基于Fmoc化学合成，将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨基酸的羧基（已经活化）作用（用NMM,HBTU作偶联剂）形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。 合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。,合成原料,Fmoc-AA(prot)-Wang
4、resin 提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质 例如：Fmoc-His(Trt)-Wang resin Prot：Boc,tBu,Trt,OtBu 侧链活性位点的保护基团 Fmoc: -NH2保护基团： Boc: Trt:,Fmoc-AA(Prot)-OH Solvent 1: DMF Solvent 2: 20%pipdine/DMF Solvent 3: 0.4M NMM/ HBTU/DMF Solvent 4: 50% ACN/DMF Solvent 5: methylene chloride Solvent 6: 94% TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O,标准合成
5、程序,Step solvent/operation volume mix time drain Rep 1 DMF 1 00:00:30 on 3 2 20%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 3 DMF 1 00:00:30 on 6 4 Reagent(AA) 1 00:00:00 off 1 5 0.4M NMM/HBTU/DMF 1 00:40:00 on 1 6 DMF 1 00:00:30 on 3,标准切割程序,Step solvent/operation volume mix time drain Rep 1 DMF 1 00:00:30 on 3 2 20
6、%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 3 DMF 1 00:00:30 on 6 4 methylene chloride 1 00:00:30 on 6 5 Dry 1 00:10:00 on 1 6 TFA 2 02:00:00 on 1 7 TFA 1 00:00:30 on 1 8 methylene chloride 1 00:00:30 on 3 9 Dry 1 00:02:00 on 1,多肽合成的一般常识,固相多肽合成一般最多只能合成到20aa。为了保证合成的效率和纯度，我们在设计多肽抗原时，一般设计14-16aa的多肽。 减少多肽序列中多个困难性氨基酸Cy
7、s, Met, Arg, or Trp的含量。 避免多肽序列中连续3到4个疏水性的氨基酸。（Val-V，Leu-L，Ile-I，Met-M，Phe-F） 避免Asp-Pro序列 避免多肽序列中最后一个氨基酸是Pro。 PIWIL3 SR0015 FFLKHGSNFQNPPP Caspase 2 SR0024 TDTVEHSLDNKDGP Caspase 7 SR0032 DRVARHFESQSDDP 切割完以后，用乙醚沉淀什么都没有,多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。 Ago2 SR0009 IVEHMVQHFKTQIF 极难溶 D
8、GCR8 SR0004 LHILSKLQEEMKRL TNFRSF19 SR0303 WSLRSQDIQYNGSELS 不溶于甲醇 可以用peptide companion 软件辅助判定多肽合成的难易程度，但是由于该软件默认了最后四个氨基酸是容易合成的，可是有时实际情况并不如此，因此依然需要综合考虑,TIE1 SR00043 DRPEETSTIIRGLN,BAG4： SR00079 LRRSGYGPSDGPSY,SR00007 Dicer GKVRVTVEVVGKGK,多肽的鉴定和纯化,合成完整长度粗肽的纯度不仅取决于多肽的本身长度和序列的特异性，还和使用的各种试剂的质量密切相关，因此我们合成
9、多肽使用的试剂都是色谱纯。 Fmoc固相多肽合成每个氨基酸的偶连效率在95%以上。对于一个15aa的粗肽，其完整长度多肽的合成效率一般在50%左右。,质谱分析（MS/ESI）,用途：测定合成的粗肽产物中目标肽的分子量，以此来衡量我们合成的肽序列是否正确 原理：将样品分子离子化后，根据离子间不同的质荷比（m/z）来分离并确定分子量。,TPTE SR00283: (CH3CO)RVSENKRRYTRDGFC MW：1887.13+42=1929.13,TNFRSF13B SR00306 （NH2）PELRRQRSGEVENNSD MW：1885.99,多肽粗品中一般含有非全长多肽,非多肽类杂质。非
10、多肽类杂质主要是指去保护过程中产生的一些保护性基团，多肽裂解过程中的一些原料如DTT、TFA等。 粗肽的一般后期纯化处理有脱盐，离子交换色谱，反相HPLC。国内外的多肽公司可以根据用户要求的纯度选择不同的纯化方法。 多肽的纯度分析一般使用反相HPLC，通常都能得到较好的分析效果。,多肽脱盐（凝胶过滤法）,原理：利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法。,表 葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性,多肽脱盐条件选择,Sephdex G-15: 适用于分子量在1500-2000
11、多肽的脱盐，对于分子量超过1500的多肽能够完全排阻。 柱子的选择：鼎国自产10mm20cm色谱柱 柱床体积：根据上样体积确定，一般柱床的体积不要少于上样体积的10%。我们一般脱盐1.0ml的多肽，柱床体积通常选者10-15ml。 洗脱速度：洗脱速度会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。流速通常选择 1ml/min 洗脱夜: PBS， 0.1M NaHCO3-0.5M NaCl(PH8.3) 检测波长：214nm,SR0002脱盐结果,称取SR0002约7.0mg,溶于1.0ml的0.1M NaHCO3-0
12、.5M NaCl(PH8.3) 过柱收集：500ul/管 OD214(空白）=0.664 (1) OD214 =0.704 (7) OD214 =0.869 (2) OD214 =0.713 (8) OD214 =1.095 (3) OD214 =0.710 (9) OD214 =0.909 (4) OD214 =0.718 (10) OD214 =0.780 (5) OD214 =0.724 (11) OD214 =0.661 (6) OD214 =0.742 (12) OD214 =0.598,峰形区带变宽，收集第（6），（7），（8），（9），（10）管共约2.5ml，会有部分损失。,多
13、肽RL-HPLC分析,RL-HPLC是一种分辨率最高的分离分析方法，可以分开长度上相差一个氨基酸的多肽。 流动相中溶质分子与固定相配基间的疏水性相互作用形成的“on-off”机制。 RL-HPLC分离多肽的基础是待分离多肽间“疏水脚”的细微差别，这些差别来源于氨基酸序列和构象的差异。,SR0001多肽的RL-HPLC分析,色谱柱：瑞典进口填料Kroamsil C18柱 250*4.6mm,5um,120A(2,000MW) 分析程序： 洗脱液A(弱移动相）:500ml 0.1%TFA in H2O 洗脱液B(强移动相）:500ml 0.09%TFA in 60%acetonitrile/40%
14、 H2O （V/V) 样品溶解：0.25mg SR0001溶于80ul A液中，加入不超过总体积25%的B液（即20ul)助溶。取80ul加入4ml的水稀释，上样20ul/1ug。,Linear A B gradient Eluent A: 0.1%TFA in H2O Eluent B: 0.09%TFA in 80%acetonitrile/40% H2O （V/V) Gradient range and time: 95%-0% A in 90 mins 5%-100% B in 90 mins Flow rate:0.8-1.0ml/mins Gradient rate:1% B/mi
15、ns Detection: 214nm Temperature: 25,SR00001 RL-HPLC分析结果,如果我们独立的看这一张色谱峰形图，我们并不能确定这个主峰就是代表合成的完整的多肽，需要联合进行质谱分析其分子量，从而最终确定该峰是否代表合成的完整的多肽。 对于合成的18个aa以下的多肽，通过RL-HPLC分析通常都能得到单一的主峰。因为在我们的合成程序中并没有引入别的反应程序，而且每步反应的效率都在95%以上，因此根据经验我们就可以认为该主峰就是代表我们合成的完整多肽。 根据实验目的来确定多肽是否需要纯化或者纯化到什么级别，免疫级别的多肽一般纯度达到70%就可以了。,多肽的溶解和保存,多数肽易溶于无菌的PBS 对于碱性肽来说（K,R,H),如果一开始用PBS不溶解，用10%或更高浓度的乙酸溶解。如果肽仍然不溶解，加入1/20体积的TFA溶解 对于酸性肽来说（D,E),如果一开始用PBS不溶解，加入1/20体积的稀氨水溶解 对于极疏水的肽用10%的乙腈或甲醇溶解 仍然不溶的极个别肽试着用DMF，盐酸胍来溶解。但是我们一般还是首选甲醇而要避开乙腈（CH3-C DMF（,-,-,-,N),CH3,CH3,
