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1、2.2 动物细胞工程,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,问题探讨,“番茄马铃薯”（理想图）,通过长期的实验，科学家们采用体细胞杂交技术获得了“番茄马铃薯”植株。,如果将奶牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶吗？,动物细胞也能融合吗？,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,一、动物细胞融合,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,一、动物细胞融合,1.概念：,动物细胞融合（cell fusion）也成细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,融合和形成的具有原来两个或多个细胞遗传物质的单核细胞，称为杂交细胞。,2.2.2 动物细胞融合与单
2、克隆抗体,一、动物细胞融合,2.诱导方法：,物理法：,化学法：,生物法：,灭活的病毒,电激等,聚乙二醇（PEG)等,仙台病毒,丧失感染性,（不感染细胞）,保留融合活性,（诱导细胞融合）,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,一、动物细胞融合,3.融合过程：,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞膜融合,细胞融合，形成杂交细胞,思考题,1.植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？,酶解法，如纤维素酶或果胶酶,2.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？,无需，因为动物细胞无细胞壁,3.植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？,离心、电激等物理方法；PEG等化学方法
3、,4.动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？,能 还可以利用灭活的病毒进行诱导,5.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形 成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？,不能,植物细胞杂交与动物细胞融合的比较,细胞膜的流动性细胞的全能性,细胞膜的流动性,纤维素酶、果胶酶,胰蛋白酶,物理（离心、振荡、 电刺激） 化学（聚乙二醇）,物理、化学方法（同左） 灭活的病毒,去除细胞壁后诱导原生质体融合,使细胞分散后诱导细胞融合,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,一、动物细胞融合,4.意义：,突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可
4、能。,5.应用：,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段； 特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体,2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体,二、单克隆抗体,1. 抗体由何种细胞产生？ 2. 抗体如何产生？ 3. 用传统的方法如何获得抗体？,(三)单克隆抗体,抗体不纯,2. 纯度低、产量低、特异性差 ；,注射抗原,(三)单克隆抗体,1、设计方案： 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,化学性质单一、特异性强的抗体,杂交细胞,2、制备过程：,骨髓瘤细胞,免疫小鼠,（选择培养基）,（抗体检测）,1、提取细胞并培养,2、 细胞融合,B淋巴细胞的融合细胞,骨髓瘤细
5、胞的融合细胞,B淋巴细胞和瘤细胞融合的细胞,3、获得的杂交细胞 （继承双亲的特点）,检验和筛选,4、杂交细胞进行细胞培养,5、得到化学性质单一的，针对性强的抗体,培养基筛选,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,应用主要有：,1、临床诊断,2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊
6、断。,单克隆抗体的应用,知识结构,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法 灭活的病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势,教学反馈,1.动物细胞融合技术最重要的用途是 （ ） A.克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体 C.培育新物种 D.生产杂种细胞,B,2.单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的（ ）A.B淋巴细胞 B.T淋巴细胞 C.骨髓瘤细胞 D.杂交瘤细胞,D,3.（多选）1975年米尔斯坦和柯勒成功地获得了单克隆抗体。下列细胞中与单克隆抗体的制备有关的是（ ） A.效应B细胞 BT淋巴细胞C.骨髓瘤细胞 D杂交
7、瘤细胞,A B C D,课后习题,1. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞， 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 （ ） 淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞自身融合细胞 小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞 A. B. C. D.,C,2.动物细胞融合和植物原生质融合决定于 ( ) A.细胞膜的流动性 B细胞膜的选择透过性C.细胞质的流动性D细胞质酶的活性,A,一.选择题,3.“生物导弹”是指 （ ） A.单克隆抗体 B.杂交瘤细胞 C.产生特定抗体的B淋巴细胞 D.在单克隆抗体上连接抗癌药物,D,4.只能使动物细胞融合的常用诱导方法是
8、 （ ） APEG B灭活的病毒 C电刺激 D离心,A,二.简答题,1.淋巴细胞是由动物体-中的-细胞分化发育而来的。 2.杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是-,骨髓,造血干,主动运输,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,练一练,A 、 B细胞为动物细胞,请据图回答问题:,A细胞,B细胞,C细胞,D细胞,(1)若A细胞为骨髓瘤细胞B细胞为淋巴细胞,那么D细胞称为 细胞,D细胞具有两个亲本细胞的特征,一方面因具有骨髓瘤细胞的 性质,通过 方式产生大量细胞
9、,我们称之为 过程;另一方面能分泌大量的抗体,我们把该过程分泌的抗体称 .,杂交瘤,连续分裂,有丝分裂,单克隆,单克隆抗体,练一练,(2)D细胞中产生的抗体其化学本质是 ,合成该物质的场所是 ,它是由 控制合成的,合成过程包括 和 两个重要步骤.,球蛋白,核糖体,基因,转录,翻译,(3)D细胞中产生的抗体具有 作用,与血清抗体相比其优越之处在于 强 高.,免疫,特异性,灵敏度,(4)若A为人细胞,B为鼠细胞,用同位素标记A细胞膜上的蛋白质,B不标记,在C细胞时,检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有.在D细胞时,检测结果发现整个细胞都有放射性,请解释原因 .,构成细胞膜的蛋白质分子大都可以
10、流动,教学参考,1.已成功的动物细胞融合实例还有哪些？,生物种类 细胞来源 成功年代 酵母菌鸡 原生质体血红细胞 1975年 人胡萝卜 腹水癌细胞原生质体 1976年 人小鼠 纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞 1978年,要知道更多的实例，需经常查阅更多科研报道。,2.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？,就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们
11、以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,3.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,
