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1、生活饮用水卫生标准,微生物检测操作相关要求 主讲：蔡艳琼（工程师）,第一节 水中微生物的基本知识,人所共知，水中生活的生物种类十分丰富。按大类来分，有动物、植物和微生物。动物又可分脊椎动物；植物也可分为高等植物和低等植物，而水中微生物种类就更多。由于我们水质生物检验的范围目前主要是微生物的检验，而且经过城镇供水的处理工艺，水中存在的生物基本上是肉眼难以见到的微生物，因此下面我们来共同学习水中微生物的检验。,1. 微生物的概念,微生物并非生物分类学上的名词，它是指肉眼不能直接看见的、单细胞或个体结构较为简单的多细胞，甚至没有细胞结构的低等生物的通称。,2. 水中微生物的种类,它包括：不具细胞结构
2、的病毒；单细胞的细菌、放线菌；属于真菌的酵母菌与霉菌；单细胞藻类；原生动物等。,3. 细菌的形态,细菌的形态多种多样，归纳起来，可分为球菌、杆菌和螺形菌。,4.细菌结构,细菌细胞主要由细胞壁、细胞质膜、细胞质、核及内含物等构成。有些细胞还有荚膜或鞭毛，有些细菌可形成芽孢。细菌细胞结构模式图。,第二节 水质微生物检验的准备,1. 水质生物检验实验室 进行水质生物检验的实验室与其它水质检验实验室不同，一般需要设置专用的准备间、缓冲间和无菌室。没有条件的也必须设置无菌操作区。生物检验实验室有以下规则，以保证检测结果的真实、精确：,一、细菌室一般守则,1. 工作时必须穿专用白色工作衣，换专用工作鞋、帽
3、。 2. 实验室务必经常保持清洁。 3. 室内禁止饮食，并且不得藏放食品。 4. 工作前后用肥皂溶液洗手，操作台在使用前后亦须进行抹揩。 5. 对接种环、试管、镊子及水样瓶口等，在使用前后须经适当火焰灭菌，操作区内必须燃点酒精灯。 6. 取样瓶、采样品、器皿及培养基等，在使用前须经过严格灭菌。 7. 显微镜要有专人保管和使用。使用油镜后必须用二甲苯将镜头揩挣。,二、培养基的制备,配制一般培养基的主要程序可分为：调配、溶化、调ph、过滤、分装、灭菌、鉴定。 三、水样的采集与保存 同一水源、同一时间采集几类检测指标的水样时，应先采集供微生物学指标检测的水样，采集时应直接采集，不得用水样涮洗已灭菌的
4、采样瓶，并避免手指和其它物品对瓶口的污染。,1. 管网末稍水水样的采集,采集应具有代表性 按500ml瓶加入0.3ml 10硫代硫酸钠除去残留余氯 出水口应充分灭菌消毒 出水3分钟后采集水样 应在4小时内进行检测,2. 水源水样的采集,首先应注意其代表性 在采集江、河、湖、库、地表水样时可握住瓶子底部直接插入水中，约距水面10-15cm处，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内。如没有水流可将瓶向前推至充满水样。 在采集一定深度水样时可使用单层采水器或深层采水器。,第三节 菌落总数的测定,菌落总数（定义） 水样在营养琼脂上有氧条件下37培养48小时后,所得1ml水样所含菌落的总数。 方法：平皿计数法
5、生活饮用水的菌落总数1ml不得超过100个 菌落总数测定的意义 可以反映水体有机污染的程度,检验步骤生活饮用水,以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样,注入灭菌平皿中,倾注约15ml已融化并冷却到45左右的营养琼脂培养基,并立即旋摇平皿,使水样与培养基充分混匀,同时做平行和空白对照, 待冷却凝固后,翻转平皿,使底面向上,置于361 培养箱内培养48小时，进行菌落计数，即为水样1ml中的菌落总数。,水源水,以无菌操作方法吸取1ml充分混匀的水样，注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管中，混匀成1：10稀释液。 吸取1：10的稀释液1ml注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管中，混匀成1：100稀释
6、液。按同法制成不同浓度稀释液。 用灭菌吸管吸取未稀释的水样和2个3个适宜稀释度的水样1ml，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。,菌落技术及报告方式,作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察。必要时使用放大镜检查，以防遗漏。也可用菌落计数器。在记下各平皿的菌落数以后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用。应以无片状菌落产生的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此平皿计数后乘以2代表全皿菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。,各种不同情况的计数方法
7、,1.首先选择平均菌落数在30300之间进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告。 2.若有两个稀释度，其平均菌落数均在30300之间，则应按两者菌落总数之比值，小于2报告两者平均数；若大于2则报告其中较小的菌落数。 3.若所有稀释度的平均菌落数大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。,各种不同情况的计数方法,5.若所有稀释度平均菌落数均不在30300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数。 6.若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以
8、未检出报告之。 7.如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm2中的菌落数，除以2求出每平方厘米内平均菌落数，乖以皿底面积63.6cm2，再乖其稀释倍数作报告。 8.菌落数在100以内按实际数报告，大于100时采用两位有效数字。两位有效后面值以四舍五入方法计算。也可用10的指数表示。,思考,1、什么是菌落总数？ 2、水源水怎么采样？自来水怎么采样？ 3、水样如何稀释？如何混匀？ 4、本项目需要什么培养基？如何配制？ 5、培养基的温度为何不能过高？合适的量是多 少？过多或过少会有什么 影响？ 6、培养时的条件是什么？为何要倒置培养？ 7、
9、培养基如何灭菌？试管如何灭菌？ 8、如何计数？如何报告结果？ 9、接种的时候，先接水样还是先倒培养基？ 10、水样和培养基如何混匀？,第四节 总大肠菌群的测定,总大肠菌群（定义）：是指一群在37培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群包括四种：大肠埃希菌属、柠檬酸细菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属。 测定意义：该菌群主要来源于人畜粪便，具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。水样中总大肠菌群的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌的存在可能性。 总大肠菌群的检测方法：多管发酵法、滤膜法、酶底物法。 生活饮用水的总大肠菌群
10、数每100毫升水样不得检出,一、 多管发酵法,多管发酵法 是根据大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气的特性进行检验，适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度高的水中总大肠菌群的测定。本方法适用面广，但操作较繁，需要时间长（三天或更长）。 多管发酵法分三步骤进行：,1. 乳糖发酵试验,将水样置于双倍浓缩乳糖蛋白胨培养液中37恒温培养24小时后，观察有无酸和气体产生。 取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，取1ml水样接种到10ml单料乳糖蛋白胨培中，另取1ml水样注入9 ml灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml（即0.1 ml水样）注入到10ml单料乳糖蛋白培养液中，每一稀释度接种5管。） 检验水源
11、水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.01ml甚至0.1，0.01，0.001ml，每一稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1ml以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1ml接种，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌刻度吸管。 将接种管置361 培养箱内,培养24h2h,如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。,2. 分离培养,将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于361培养箱内培养18h24h,观察菌落形态，挑取符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检和证实试验。 a.深紫红色、具有金属光泽的菌落； b.紫黑
12、色、不带或略带金属光泽的菌落； c.淡紫红色、中心色较深的菌落。,3. 证实试验,经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，与361培养24h2h,有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。 结果报告 经镜检、生化反应证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml水样中的大肠菌群最可能数（MPN）值。,总大肠菌群测定的关键步骤,产酸判断：紫色培养液变成黄色 产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；红色、粉红色菌落。 抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。,思考,1、
13、单倍乳糖蛋白胨培养液和双倍、三倍乳糖蛋 白胨培养液有什么不同？如何配制？在什么情况下加单倍乳糖蛋白胨培养液，什么情况下加三倍乳糖蛋白胨培养液？ 2、生活饮用水、地表水如何稀释？ 3、如何确定接种量？ 4、初步发酵后如何判断阳性管？阴性管？ 5、今天做什么 ？怎么做？,问题,1、 本项目需要做几次才能完成？ 2、本项目需要配置哪几种培养基？每个组需要配置多少培养基？ 3、我们今天需要做什么？ 4、如何测定水源水，稀释多少倍比较合适？ 5、总大肠菌群测定的步骤与耐热大肠菌群测定的步骤，相同之处有哪些？不同之处有哪些？ 6、如何进行革兰氏染色？关键步骤是什么？ 革兰氏染色四大基本步骤： 结晶紫初染、
14、 碘液媒染、 乙醇脱色、 沙黄复染， 其中乙醇脱色是关键。 因为如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性， 如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性 。 7、平板分离后进行革兰氏染色镜检的菌落应该具备什么特征？ 8、MPN表怎么查？,二、 滤膜法,总大肠菌群滤膜法 是指用孔径为0.45m的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在品红亚硫酸钠培养基上37培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性菌以检测水中总大肠菌群的方法。 滤膜法适用于饮用水、水源水，特别是低浊度水样中总大肠菌群的测定。本法适用于较大量水样测定，如原水量少可加无菌水稀释。本方法简单快速，较为精密。,检验步骤,1 准备工
15、作 滤膜灭菌: 将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中煮沸灭菌3次,每次15分钟,前两次煮沸后需更换水洗涤2-3次,以除去残留溶剂。 滤器灭菌: 用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用103.43kpa高压锅灭菌20分钟。,2 过滤水,用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙 面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100ml水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀们，在负0.5大气压下抽滤。,3 培养,水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸纳培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者
16、间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放37恒温箱内培养24h2h。,4 结果观察与报告,挑取符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检： a. 紫红色、具有金属光泽的菌落； b. 深红色不带或略带金属光泽的菌落； c. 淡红色、中心色较深的菌落。 凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液，与37培养24h,有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。 报告 计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100ml水样中的总大肠菌群数（CFU/100ml)报告之总大肠菌群菌落数（CFU/100ml）=数出的总大肠菌群菌落数100过滤的水样体积ml,检测方法（小结）,储备培养基的制备过滤（需器械灭菌等）培养（22-24H） 阴性结果（无典型菌落） 观察菌落形态,挑取特征菌落 革兰氏染色，镜检 证实试验（361培养箱中培养242h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在,第五节 耐热大肠菌群的测定,耐热大肠菌群(原名：粪大肠菌群) 耐热大肠菌群的基本性状与总大肠菌群相似，而且是总大肠菌群的一部分。为了区别存在于自然环境中的大肠菌群和存在
