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1、,第四章 色谱分离法,4 色谱分离法(chromatography), 4.1 基本原理 色谱法是一种物理化学分析方法。根据所用样品混合物中各组分物理、化学性质的差异，各组分程度不同的分配到互不相溶的两相中。当两相相对运动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。 固定相：固定不动的一相 流动相：移动的一相, 4.2 色谱法的分类,1)根据流动相分类: 气相色谱以气体作流动相 液相色谱以液体作流动相 超临界色谱流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体 2)根据固定相的附着方式分类 固定相装在圆柱管中柱色谱固定相涂敷在玻璃或金属板上薄膜 色谱（平板色谱）液体固定相涂在纸上纸色
2、谱(平板色谱),气相色谱仪的流程,I -载气系统; II -进样系统; III-色谱柱和柱箱; IV-检测系统; V -记录系统,液相色谱仪的流程, 4.3 离子色谱分析法,一、离子色谱法(IC)的优点 二、离子色谱法的局限性,三、离子色谱法的基本原理 （一）、IC的分离原理 （二）、电导检测器和抑制柱作用原理,四、应用示例, 4.4 纸色谱法(Paper chromatography),将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量的液-液分配色谱法,固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） 分离机制：同液-液分配色谱 定性参数：,Rf值测量示意图,L0,
3、L1,L2,讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分易保留,Rf 小(流动相极性, Rf） 非极性组分易流出, Rf大(流动相极性,Rf),一、比移值的作用及影响比移值的因素 例：分离K+、Rb+、Cs+，可用盐酸饱和的苯酚作流动相，其Rf值分别为：K+ 0.19, Rb+ 0.26,Cs+ 0.48;若用苯酚-甲醇-盐酸作流动相，则其Rf值分别为：K+ 0.00, Rb+ 0.19,Cs+ 0.46;请问哪种体系的分离效果好，为什么？,前一体系：Rf(Rb+ - K+)=0.26-0.19=0.07 Rf(Cs+ - Rb+)=0.48-0.26=0.22 后一体系：Rf(Rb+
4、- K+)=0.19-0.00=0.19 Rf(Cs+ - Rb+)=0.46-0.19=0.27 两元素的Rf相差越大，越易分离，所以第二种分离效果好。,例2：在某一溶剂体系中，A元素的 Rf值为0.40，B元素的Rf值为0.50，今欲将它们分开，若两斑点的直径均为1cm,要求相隔1cm，（即两斑点中心的距离为2cm），问应取多长的泸纸？,A斑点的Rf=a/c=0.40, B斑点的Rf=b/c=0.50 a=0.40c b=0.50c b-a=2=0.50c-0.40c=0.10c c=20cm 20+4+3=27cm,二、薄层色谱法 （一）薄层板的制备方法 三、薄层色谱与纸色谱的比较及应用
5、, 4.5 生物大分子的色谱分离法,生物试样：酶、蛋白质、核酸、多糖 生命科学的发展需要提供高纯试剂； 色谱法是目前最有效的制备级的分离方法； 基因工程中，治疗用蛋白的分离纯化即采用高压制备液相色谱； 空间排阻液相色谱：蛋白质大小差异，通用型蛋白分离纯化工具；,生物大分子的色谱分离法,亲和色谱：利用固定相配基与生物大分子之间的特殊生物亲和力的不同实现分离； 例如：将过渡金属离子Cu2+ 、Zn2+ 、Ni2+ 等以亚胺金属配合物的形式键合到固定相上，由于组胺酸和半胱胺酸能与这些离子形成配位键，形成亚胺-蛋白螯合物，故含有这两种氨基酸的蛋白质可以被这种亲和色谱固定相分离。 离子交换色谱：利用蛋白
6、质具有不同的等电点分离。, 4.6 膜分离技术与生物试样分离1. 透析 超滤分离技术,原理：透析是采用半透膜作为滤膜,使试样中的小分子经扩散作用不断透出膜外,而大分子不能透过被保留，直到膜两边达到平衡。 特点：半透膜两边均为液体，一边为试样溶液，另一边为纯净溶剂（水或缓冲溶液）。可不断更换外层溶剂使扩散不断进行，直至符合要求。 应用：制备或提纯生物大分子时，除去小分子物质及其杂质，脱盐。,用于透析的半透膜应具备的条件,1）在溶剂中能膨胀形成分子筛状多孔薄膜，只允许小分子溶质通过，而阻止大分子（如蛋白质）通过； 2）化学惰性； 3）在水、盐溶液、稀酸或稀碱溶液中稳定； 4）有一定的机械强度和良好
7、的再生性能。,2. 透析的装置与方法,半透膜可制成管状，按需要截取一定长度，将一端封闭后，装入需要透析的试样溶液后，放入盛有溶剂的透析缸中。 商品透析管常涂有甘油以防干裂，也可能含有其他微量杂质。 预处理：用50%乙醇慢慢煮沸一小时，再分别用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢纳溶液、0.001 mol/L EDTA 溶液依次洗涤，最后用蒸馏水洗涤三次；,透析过程注意点：,1）透析前，对装有试液的透析袋检查是否有泄漏； 2）透析袋装一半左右，防止膜外溶剂因浓度差渗入将袋涨裂或过度膨胀使膜孔径改变； 3）搅拌；定期或连续更换外部溶剂可提高透析效果。,3. 超滤,超滤是指外源加压的膜分离，其原理与
8、过滤一样。依据所加的操作压力和膜的平均孔径的不同，可分为三种模式： 1)微孔过滤 操作压力为0.07 MPa，膜的平均孔径为500埃至14 m，用于分离较大颗粒； 2)加压超滤 操作压力为0.03-6 MPa，膜的平均孔径为10-100埃至14 m，用于分离大分子溶质； 3)反渗透 操作压力为30-120 MPa，膜的平均孔径为10埃以下，用于分离小分子溶质；,4. 超滤装置与应用,超滤装置：目前应用最广的是采用中空纤维系统的超滤装置，其是由多根空心纤维细管成束地装配而成。 空心纤维细管横截面的内表层细密，向外逐渐疏松，形成各向异性微孔膜管结构，管内径一般为0.2 mm，有效面积约1cm2，表
9、面积与体积的比率极大，故滤速很高。 DC-30型中空纤维系统的超滤装置：三组中空纤维套筒，膜表面积2.7 m2，在3个大气压下，滤液流量可达 1L/min。 中空纤维系统的超滤装置用于透析、脱盐，在不到一小时可从溶液中除去99%的水。,应用：,应用：浓缩酶、蛋白质、核酸、多糖； 酶的浓缩回收率可达90%。 特点：简单、经济、高效、快速的分离 方法。, 4.7 气浮分离法原理,采用某种方式，通入水中大量微小气泡，在一定条件下使呈表面活性的物质吸附或粘附于上升的气泡表面而浮升到液面，从而使某组分得以分离的方法浮选分离法或泡沫浮选分离法。,气浮分离法原理, 4.8 固相微萃取分离法(Solid-ph
10、ase microextraction),原理 将涂有高分子固相液膜的石英纤维插入试样溶液或气样中,对待分离物质进行萃取,经过一定时间在固定相涂层和水溶液两相中达到分配平衡,从而使待测物质分离.是一种非溶剂型萃取法. 直接固相微萃取分离法 顶空固相微萃取分离法, 4.9 毛细管电泳分离法,1.电泳:荷电物质在电场中因受到吸引和排斥而引起的差速流动. 2.电泳分离:是依据在电场中溶质不同的迁移速率. 3.毛细管电泳分离原理:在充有电解质的毛细管两端施加高电压，利用电位梯度和离子淌度的差别，实现流体中组分的电泳分离。其分离机理有： 静电或离子相互作用、氢键作用、空间位阻作用、偶极-偶极相互作用、-相互作用,毛细管电泳仪器结构示意图,毛细管区带电泳分离原理,毛果芸香碱对映体的毛细管区带电泳手性分离,毛果芸香碱是一种缩瞳药，可用于青光眼及调节性内斜视等眼科疾病的治疗。采用毛细管区带电泳对其进行手性分离尚未见报道。 采用-环糊精及其衍生物作为手性选择剂，运用CZE对毛果芸香碱对映体进行了分离 。,毛果芸香碱的结构式 Structure of pilocarpine,环糊精类型对手性分离的影响,分离条件:背景电解质，15mmol/L CD-50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH=2.5；分离电压，20kV；柱温，20,HP-CD,DM-CD,-CD,再见,
