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1、动物细胞工程,范彩云,第二节 动物细胞培养技术,一、动物细胞培养的基本方法 （一）原代培养 将动物机体各组织取出，经酶、螯合剂或机械方法处理，分散成单细胞，置培养基中培养，使细胞生存、生长和繁殖。 取材-制备培养材料-接种-加培养液-培养。,原代培养的方法,计数,消化原代培养法,（二）传代培养,使原代细胞经过重新分散接种的过程称之为传代。 每次分离再培养为一代，传5-10代以内的细胞称为次代培养细胞。10-20代以上的为传代细胞。,取材,制备培养材料,接种,加培养液,培养,（三）细胞的纯化与克隆,细胞纯化：自然纯化和人工纯化 细胞克隆：单个细胞分离技术。 从细胞群体中分离出一个细胞，使其在体外
2、培养体系中繁殖诚信的细胞群体，这种单个细胞所形成的细胞群或集落成为一个克隆，这种纯化后的细胞群体成为细胞株。,（四）细胞的冷冻与复苏,第三节 动物细胞融合,一、动物细胞融合原理 （一）细胞融合的概念 又称体细胞杂交， 将不同来源的原生质体 相融合并使之分化再生、 形成新物种或新品种的 技术。,（二）细胞融合的原理,通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂种细胞，再以适当技术进行杂种细胞的分捡和培养，促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成杂种个体，实现基因在远缘物种间的转移。,二、细胞融合技术,生物法,第四节 杂交瘤技术和单克隆抗体技术,杂交瘤技术的基本原理： 杂交瘤抗体技术的基本原理是通
3、过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是： 骨髓瘤细胞：可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。 脾细胞（B淋巴细胞）：它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长。 在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。,细胞融合技术：,长命 不分泌抗体,分泌抗体 短命,分泌抗体 长命,杂交瘤技术的操作流程,一. 动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,杂交瘤技术的操作流程,一. 动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的
4、检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,特定目标抗原,动物,免疫,脾脏中B淋巴细胞,B淋巴细胞大量增殖,刺激,能分泌针对于该抗原的特异性抗体,杂交瘤技术的操作流程,一. 动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,细胞融合方法,1.病毒介导的细胞融合 2.聚乙二醇（PEG）介导细胞融合 3.电激融合,融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，,杂交瘤技术的操作流程,一. 动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,要求： 简便、快速、敏感; 在
5、短时间内能检测大量样品,1.酶联免疫吸附法 2.间接免疫荧光法 3.放射免疫法 4.双相扩散法,常用方法：,酶联免疫吸附法(ELISA),技术原理：,待检杂交瘤培养上清液,杂交瘤技术的操作流程,一. 动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,常用克隆化方法,有限稀释法 软琼脂平板法 显微操作法,80个细胞/96孔 饲养细胞(feeder cells),ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。,杂交瘤技术的操作流程,一. 动物免疫,二、细胞融合及HAT筛选,三、抗体的检测,四、杂交瘤细胞的克隆化,五、大规模培养批量生产单克隆抗体,
