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1、实用组织学与细胞化学 研究技术 组 织 学 技 术,一 组织学技术的发展与应用 内 容： 组织学制片技术、胚胎学制片技术、组织化学技术、荧光技术、免疫组化技术、组织培养技术、组织工程技术等。 光学显微镜技术：特殊显微镜技术（荧光、倒置、相差）、显微摄影技术等 电子显微镜技术：电镜技术、电镜细胞化学技术等 应 用：Hooke发现细胞，1811年改良了显微镜组织学基础。但是，不能看到透明的切片标本。 1851年，发现卡红可染细胞核，1865年，苏木精能染细胞核。 十九世纪20年代Feulgen创立核酸反应。 30年代，相继发明了相差显微镜。 特别是，50年代组织化学与电镜技术迅速发展和提高，组织学
2、技术进入了新时期。,二 组织切片方法分类 1切片法：石蜡切片、明胶切片、火棉胶切片、电镜超薄切片等（微米） 2涂片法：血液等液体 3磨片法：骨等坚硬组织 4分离制片法：分离单个细胞平滑肌细胞、肝细胞等 5印片法：肝、脾、淋巴结等 6活体制片：注射胎盘兰等，观察巨噬细胞的活动 7超活体染色制片：活体观察精子形态与活动等 8整体切片法：用大型切片机，人胚、肝、肾、脑等,组织制片技术 普通制片技术HE切片术 一 基本程序 (一). 动物取材 必须根据科研或教学的目的与要求确定，医学领域以人的材料为最好，高级动物猴、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠等。 动物麻醉法： 1乙醚吸入麻醉：小鼠、大鼠、豚鼠等。在玻璃
3、缸内进行。 2注射麻醉法：苯巴比妥、乌拉坦等，猴、猫、狗、兔等大型动物，静脉或腹腔注射。 3 直接杀死法：小鼠、大鼠、豚鼠等，用金属器械猛击后脑部第四脑室区。,取材顺序： 1 腹腔器官： 肝、胆、胃、肾上腺、胰、脾、 十二指肠、空肠、回肠、结肠等 2胸腔器官： 心脏、肺 3盆腔器官： 膀胱、卵巢、输卵管、子宫等 4神经系统： 大脑、小脑、脊髓等 5眼球、内耳,（二） 固定 目 的：保持组织内细胞的形态、结构及其化学组成，使与生活时原有形态、结构及化学组成相似。 1蛋白质、脂肪、类脂体、酶等沉淀或凝固抑制自溶。 2组织内各种不同物质产生不同的折光率，便于显微镜下观察。 3某些固定剂可起到硬化作用
4、，有利于组织切片：甲醛、乙醇、氯仿等。 4某些固定剂可起到媒染作用：重铬酸等。 固定具体方法： 1小块固定法 11 0.3cm（不超过0.5cm厚）。 2整体固定法 （小动物灌流法），效果好。 固定液能迅速渗透到各器官、组织。 具有一定硬度，有利于薄切。 可避免因取材时间过久保持新鲜状态。 3蒸汽固定法 用于涂片、印片等（骨髓涂片、淋巴印片）。,固定液：应具有以下性能 1. 对蛋白质、脂肪、类脂体、碳水化合物等具有沉淀、凝固作用。 2. 具有一定穿透力迅速进入组织。 3. 对组织不引起收缩或膨胀。 4. 对组织产生一定的硬化作用。 5. 具有一定pH值。 6. 对染色无副作用。,常用固定剂：
5、1. 单纯固定剂： 甲醛、乙醇、丙酮、重铬酸甲、锇酸等。 甲醛： 常用，pH值为中性。穿透组织速度快，固定均匀，组织收缩小。它是蛋白质最好的固定剂，在组织化学中广泛应用。 乙醇： 常用的固定剂与保存剂，穿透组织速度快。具有固定、凝固蛋白质作用，亦具有硬化组织和脱水等作用。 丙酮： 可作固定剂与脱水剂，对某些酶（碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等）固定效果好。 锇酸： 强氧化剂，不能与甲醛、乙醇等混合。使蛋白胶状固定而不发生沉淀，为脂肪、类质脂、髓鞘等优良固定剂。目前为电镜标本常用的固定剂。 2. 混合固定剂 ： 甲醛混合固定剂、乙醇混合固定剂、丙酮混合固定剂、重铬酸甲混合固定剂、锇酸混合固定剂等。,（三
6、） 冲洗 目 的： 1停止固定液继续对组织的作用。 2除去组织中多余的固定剂，以免影响染色。 方 法： 1. 简易流水冲洗法。 2 系列玻璃瓶或水槽冲洗法。,(四）脱水 目 的： 1. 除去组织中含有的水分脱水。 2. 脱水后便于石蜡包埋等。 脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等。 方 法：由低浓度逐渐升高浓度，以避免组织收缩。 23mm 5mm 50%Alc 68h 612h 70% 68h 612h （过夜）,80% 46h 68h 95%（） 24h 36h 95%（） 24h 36h 100%（） 12h 24h 100%（） 12h 24h,（五） 组织透明 乙醇不能与石蜡混合，需要经过一种
7、乙醇与石蜡之间媒 浸物，即透明剂。透明剂可能取代乙醇而使组织呈透明 状，而液态石蜡则可取代透明剂乙醇进入组织。当液态 石蜡形成固态之后，便于薄切。 常用透明剂： 二甲苯 易挥发，折光率1。497，沸点144，透明力强。 此外，甲苯、苯、氯仿、丁香油等。 步 骤： 1先二甲苯：纯乙醇（1：1） 2二甲苯,（六） 包埋 1渗蜡（浸蜡）： 重要步骤。熔化为液态的 石蜡透过组织间隙进入到组织中。 步骤：（1）软蜡：熔点54560C 透蜡 （2）硬蜡：熔点56580C 渗蜡 以上均在温箱中进行。 不能超过600C，否则变脆、收缩。 2. 包埋： 硬蜡 60620C,（七） 切片 切片机：回转切片机、滑动
8、切片机、冷冻切片机等 切片是整个制片过程中关键的步骤（切片厚度：46m） （八） 切片贴展 将薄切的切片贴附载玻片上 要 求： 1牢固，染色时不能脱落。 2展开皱褶，不影响将来的观察。,（九） 染 色 染 料： 根据染料的来源分为天然染与人工染料两种。 染色化学性质分为弱酸性、强酸性、弱碱性、强碱性及中性。 依染色对象分为胞核染料与胞质染料。 1染料的来源 天然染料： 为天然产物，从动物或植物体中提取的 苏木精 从苏木树的树心中提炼出来的为优质的细胞核染料。 胭脂红（卡红） 雌性介壳虫（胭脂虫）中加工而得染色质着色最佳。 地衣红（俄西印） 地衣纲质物（茶荠地衣）中提取弹 性纤维染料。,人工合成
9、染料： 由芳香环或具有芳香环性质的杂环化合物所构成。 硝基类（苦味酸）： 胞浆染料 醌型苯环类： 甲基绿、甲基紫、酸性复红、水溶性苯胺兰、孔雀绿、 亮绿等。 丫叮染料： 伊红丫、丫叮黄等。 醌亚胺类染料： 美兰、甲苯胺兰、硫堇、中性红等。 偶氮类染料： 偶氮卡红、桔黄G、苏丹、刚果红、胎盘兰等。 （十）封片 HE染色的步骤与方法 染色步骤: 1.切片脱蜡 二甲苯 510分钟 2.切片从而甲苯中取出,无水乙醇中13分钟,洗去石蜡和二甲苯 3.切片浸入95%乙醇中13分钟,组织切片呈白色 4.切片浸入80%乙醇中12分钟,逐步降低乙醇浓度 5.切片经lugol氏碘乙醇35分钟,除去组织中的汞盐沉淀
10、 6.普通水冲洗碘液 7.金如5%硫代硫酸钠12分钟,洗去棕色 8.普通水-蒸馏水漂洗,以备染色 9.切片入苏木精染色,1015分钟 10.水洗,11. 切片经盐酸-酒精分色1020秒.此为苏木精染色个关键-细胞核染成深蓝色 12. 充分水洗(注意:不要洗掉切片!) 13. 0.51%伊红染胞质310分钟,淡红色即可 14. 95%乙醇中分色13分钟,洗去切片上多余的伊红 15. 95%乙醇中继续分色13分钟 16. 100%乙醇中脱水鉴别23分钟 17. 100%乙醇中完全脱水23分钟 18. 立即二甲苯中透明35分钟 19. 中性树胶封片 20. 镜检染色结果:细胞核-深蓝色,细胞质-红色,结缔组织为淡红色, 肌纤维为红色,胶原纤维为红色,软骨组织为深蓝色,红细胞为桔红色 涂片:血液等 铺片:疏松结缔组织、肠系膜等 磨片：骨、牙等 人工假象：凡是标本制作过程中产生的人为现象为人工假象。缩、涨、裂、 褶、色素沉着等。 几种特殊显微镜： 1相差显微镜 观察组织活细胞，标本不染色，反差小。 2倒置显微镜 目镜在下，光源在上，观察瓶底培养的活细胞。,人工假象,小 结: 1。简述HE切片制备的大体程序？ 2。组织切片有几种方法？ 3。简述组织取材的大体顺序？,谢 谢！,
