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1、.,1,基因转染,.,2,报告内容,一 转染的简介 二 转染的分类 三 转染的方法 四 转染后筛选,.,3,一 、 转染的简介,1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。 2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。,.,4,二 、转染的分类,.,5,三、转染的方法,基因转染的基本方法可以分为： （1）重组子的构建 （2）基因转染真核细胞的方法,.,6,重组子的构建,1.目的基因的制备和获取 2. 哺乳动物细胞表达载体的选择 3. DNA片断的重组连接 4. DNA重组体的鉴定,.,7,1.目的基因的制备和获取,(1)目的基因 是所要研究或
2、应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段 (2)目的基因常用的制备方法,.,8,A.限制酶切除 a.从原核基因组DNA制备视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。 b. 从真核基因组DNA制备 c.从已克隆的DNA片段制备,.,9,B. PCR或RT/PCR方法制备目的基因 a. 获取已知基因 据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知） 设计/合成一对引物 PCR（基因组DNA为模板）/RT-PCR(mRNA为模板) 从组织或细胞制备目的基因 b. 构建RT/PCR文库法获取未知基因 据mRNA末端如polyA尾设计共同引物 将所用mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDN
3、A末端加尾 采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体 构成PCRcDNA文库筛选,.,10,C.计算机克隆即利用GenBank信息，利用不同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因片段，这有赖于各种计算机软件的应用。 D.化学合成法制备基因片段用DNA合成仪，对目的基因分段合成，连接，可以得到所需的目的基因。,.,11,2.哺乳动物细胞表达载体的选择,哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体 （1）质粒型载体 哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。 A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作
4、用元件: a.启动子 b.增强子 c. 多聚腺苷酸化信号 d. 药物选择标记基 e. 报告基因 f.表位标签,.,12,B.常用的哺乳动物表达质粒载体 a. pcDNA3.l b. pSI c. pCMV-HA d. pBudCE4.1 e. pTRE,.,13,2）病毒型载体 病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等。 A逆转录病毒载体 逆转录病毒的优点是，可以使外源基因整合到基因组中，因而可以被稳定传代和表达。但是，由于逆转录病毒的插入位点
5、是随机的，因而在基因组内的整合有可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。,.,14,B.腺病毒载体 易于培养、纯化，在感染过程中复制与转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较大的外源基因片段，且腺病毒基因不会发生整合，是研究真核基因的良好模型。,.,15,3.DNA片断的重组连接,.,16,4. DNA重组体的鉴定,外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定DNA重组体 （1） 酶切鉴定是必需的，基于下述: A. 限制性图谱个
6、体特异性，不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。 B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不同的 。,.,17,C. 插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点)酶切，一般来说用3种限制酶切： 可鉴定载体及 插入片段的大小,方向,切后并电泳分析,以确定是否得到预期的rDNA。 2）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可进行在序列测定。 （3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。,.,18,基因转染真核细胞的方法,.,19,(1).DEAE-葡聚糖 是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚
7、体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。,.,20,(2). 磷酸钙共沉淀转染法 由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人DNA。,.,21,（3）.脂质体介导法（目前应用最广泛） 【原理】：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞
8、浆中。,.,22,此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。,.,23,【主要应用】:瞬时转染 稳定转染 【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。,.,24,利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。,.,25,
9、此图为脂质体转染后荧光蛋白的表达,.,26,物理方法,包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。 （1）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。,.,27,(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法 该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体
10、的细胞。,.,28,病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统，因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有一定的病毒操作经验和良好的设施。 （1）逆转录病毒 （2）腺病毒,.,29,四 转染后筛选,筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒上所带的真核筛选抗性基因有关的 。 标有neo（实际上应该是neo resistance）的载体，指载有降解新霉素的基因，新霉素作用于原核和真核细胞，对两者都有杀伤作用。用于转染后，稳定表达外源基因细胞的阳性筛选。,.,30,标有amp（实际上应该是amp
11、 resistance）的载体，指载有降解氨苄青霉素的基因（内酰胺酶），作用于原核细胞，只对敏感菌有作用。用于克隆菌的筛选。 最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo，所以筛选的时候用G418 。G418是目前获得稳转最常用的试剂之一。,.,31,G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核细胞等都有毒性，包括细菌，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷类磷酸转移酶可以将G418转变成无毒性状。,.,32,当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，
12、则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。目前G418的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。,.,33,转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如此），需要被转染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无论在何种情况下，转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。,.,34,1 细胞 （1）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3）传代次数 （4）细胞数量（融合率）,.,35,
13、2 交叉污染 如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。,.,36,3 载体DNA 一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。 （1）载体完整性 （2）载体制备物,.,37,4 组织培养试剂 一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。 (1)基础培养基 (2)胎牛血清 (3)添加剂,.,38,5 转染方案 一般原则：建立一套适当的转染方案；首先从一种标准方案开始，然后通过改变试剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。 （1）转染复合物的制备 （2）转染试剂/DNA配比（负载比） （3）转染复合物的加入 （4）形成转染复合物所用的稀释剂,.,39,6 时间进度 一般原则提示：要确保最终结果的成功；建立一个合适的时间进度进行转染实验以保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。 （1）转染的开始 （2）培养基更换 （3）时间测定,.,40,谢谢指导！,/10/29,.,41,
