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1、第三章 细胞工程基本技术,一、细胞工程实验室的设置 1 动物细胞工程实验室的设置 无菌操作室：更衣间、缓冲间、操作间 培养观察室 制备室 储藏室 清洗与灭菌室,2 植物细胞工程实验室的设置 除与动物细胞工程实验室相同的设置外，还有些特殊要求，如光照、试管苗培育和移植驯化等。,二、常用仪器与设备,超净工作台 倒置显微镜和相差显微镜 干燥箱 水纯化装置 冰箱（4 、-20、 -70） 压力蒸汽消毒器,细胞记数板和电子细胞记数仪 过滤除菌装置 离心机 移液管、吸管 离心管 移液器 天平,动物细胞工程实验室基本设备仪器,1 培养箱,二氧化碳培养箱，提供恒定CO2（5%）以稳定pH值，温度：哺乳类35-
2、37，鸟类38.5，气相：O2、CO2、pH7.2-7.4,2 显微操作仪,3 细胞融合仪,4 细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮罐-196）,5 培养用器皿 各种培养瓶、 培养皿、多孔培养板（6、24、96） 6 手术器械等,植物细胞工程实验室基本设备仪器,光照培养箱 人工气候室 摇床 培养瓶,三、实验室的生物安全,根据密封程度的不同,将生物安全分为四个等级,即: P1、P2、P3、P4 （protect） 一般细胞培养按一级生物安全标准，其基本要求是： 1、限制随便出入实验室；2、操作前后要消毒；3、不能用口吸取液体；4、禁止在室内进食、吸烟和存放食品；5、操作时着专门实验服；6、处理细胞
3、前后要洗手；7、操作时在超净工作台。,四、培养用品的清洗,在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件，因此对培养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节。 清洗的目的是清除杂质和微生物,使器皿内不残留任何影响细胞生长的成分(有害物质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成分）。,1、玻璃用品的清洗 在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此，玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行。 一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。, 浸泡 初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用
4、清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。培养后的玻璃器皿多附有大量蛋白质，用完后应立即初步刷洗，浸泡在蒸馏水中，注意让水完全进入瓶皿中，不要留有气泡。使用新的器皿应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸(5)浸泡过夜或煮沸30分钟，中和其中的碱性物质后再清洗。 刷洗 浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加热）刷洗。, 浸酸 刷洗不掉的极微量杂质经过清洗液浸泡的强氧化作用可被除掉。清洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污十分有效，是清洗过程中关键环节。清洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成。浸泡时器皿要充满洗液，不留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。,清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用
5、的有下面三种： 强液：重铬酸钾63g，浓硫酸1000ml，蒸馏水200ml 次强液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml 弱液：重铬酸钾l00g，浓硫酸l00ml，蒸馏水1000ml 配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入浓硫酸。 新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，应废弃而重新配置。 也可以使用1040的硝酸溶液。, 冲洗 玻璃器皿浸酸后必须用流水充分冲洗，每个器皿用流水灌满、倒掉，必须重复十次以上，不留任何残迹。最后用蒸馏水漂洗23次，用双蒸水漂洗1次，烤干备用。 玻璃滤器原则上与玻璃器皿清洗相同。无论是浸泡还是
6、浸酸、冲洗，都需用抽滤的方法。,2、橡塞清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗。胶塞类橡胶用品，每次用后先用蒸馏水浸泡，然后用2NaOH煮沸10-20 min，用自来水冲洗干净，再用1稀盐酸浸泡30min，用自来水冲洗、蒸馏水漂洗2-3次，最后双蒸或三蒸水漂洗1次，晾干后备用。,3、塑料器皿的清洗 细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要是进口的一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。 如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉残留附着物，用2NaOH浸泡过夜，流水冲净后再用5盐酸浸泡30min，自来水冲洗、蒸馏水漂洗2
7、3次，最后三蒸水漂洗2次，晾干备用。,五、消毒灭菌,防止细菌、真菌和病毒等微生物的污染。 消毒灭菌的方法有多种，随物品不同，采用不同的方法。总的来说有物理方法和化学方法两大类。 物理法包括：湿热(高压蒸气)、干热、过滤和紫外线等方法杀灭或去除微生物。 化学法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。,（一）物理灭菌法 1、紫外线消毒 常用来消毒空气，操作表面和一些不能用其它方法消毒的物品(如塑料培养皿等)。一般距紫外灯2.5米范围内直接照射20分钟即可。 、电离辐射消毒 适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的用品。,、湿热灭菌 湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械
8、、玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌。 各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，一般培养用液、橡胶制品要求10磅(114)，1020分钟或8磅(112)30分钟。布类、玻璃制品、金属器械等为15磅(12l)20分钟。 。,、干热灭菌 主要适用于玻璃器皿的消毒灭菌。用电热鼓风干燥箱加温到160，保持1小时或更长时间，可达到消毒目的。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法。 灼烧也属于干热消毒灭菌方法,、滤过除菌 大多数培养用液，如人工合成培养液、血清、酶溶液等，在高温下会变性，失去功能，必须采用滤过法除菌。 玻璃滤器适用于各种培养液的滤过除菌。玻璃滤器根据滤板的孔径分为G1一G6几种规格，
9、一般采用G6型(孔径在1.5m以下)，可达到除菌目的。 微孔滤膜滤器，应选用孔径为0.22m的滤膜过滤除菌。 各种滤器必须先经高压蒸气消毒、烤干后方可使用。,（二）化学消毒法 、消毒剂 细胞培养室的工作面、家具、墙壁、地面和空气等可用消毒剂进行灭菌处理。如：75酒精常用于皮肤和瓶皿开口部位的消毒；0.1新洁尔灭是目前最常用的消毒剂，可以对器械、皮肤、操作面进行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空气消毒：来苏儿可用于地面消毒；过氧乙酸消毒能力很强，在0.5%的浓度下，10min就可将芽孢菌杀死。甲醛是一种光谱灭菌剂，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。,、抗生素 抗生素主要适用于培
10、养用液消毒灭菌，不同种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是为了预防。 最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大霉素等。常规培养用液抗生素浓度为：青霉素100单位ml、链霉素100单位m1、庆大霉素50gm1或l00gm1。,六、污染检测与控制 污染：一切与培养无关的杂质（微生物、化学物、细胞等）进入培养系统，影响培养物的正常生理机能。 在众多的污染源中，微生物是最突出最重要最常见的污染。 (一)微生物污染的途径 空气、器材、操作、血清和组织样本等。,（二）污染对培养细胞的影响及检测,1、细菌的污染检测与控制 当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，产生大量酸性物质。显微镜下观察可见培养液中有大量圆球状
11、颗粒漂浮，细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、崩解死亡。 采用普通肉汤培养基也可以检测到污染。 用青霉素、链霉素可预防细菌的污染,2、真菌的污染检测与控制 常见污染真菌有烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等。在培养液表面会出现白色或浅黄色漂浮物。显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝。 可用抗真菌剂防止真菌污染。,3、支原体的污染检测与控制 支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观上看不出明显的变化，实际上或多或少的影响到细胞的众多机能。目前尚无有效的防范措施。可通过支原体培养、PCR及电镜观察等方法进行检测。 支原体的去除可采用：41C,4、病毒的污染
12、检测与控制 病毒的污染主要是通过DNA的整合，改变培养细胞的生物学性状，影响细胞的生长或干预实验结果的准确性。 对病毒的检测主要有直接观察、动物接种检查、电镜观察、免疫学及PCR法。,5、细胞交叉污染及检测 在培养的细胞中混杂有其它细胞，从而对培养的细胞产生形态或生长特性等方面的影响。常采用形态观察或检查细胞的标记物进行检测。 有效防治采取的措施：1）严格操作，器具分明，空间隔离；2）细胞的取放严禁接触培养液瓶口；3）对培养的细胞要有充足的储备。,（三）污染的预防 1、培养操作前的准备(超净工作台的严格护理) 2、培养操作时的注意事项 3、其他注意事项,七、无菌操作技术（无菌操作的基本要领和要
13、求）,在细胞培养中防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。为达到这一要求，所有工作要进行得有条不紊和安全可靠。,（一）培养前的准备 要充分做好培养前的实验用品准备工作，根据研究内容的要求进行物品清点包装，注明标签后灭菌、烤干备用。在工作前移入超净工作台内。 （二）培养室和超净工作台的消毒 工作面先用新洁尔灭擦拭一遍后，打开紫外线灯灭菌，用30W紫外线灯管直接照射2030分钟。然后关闭紫外灯，打开风机。超净工作台要用75酒精擦拭。培养用液和培养细胞不能放在紫外线下直接照射，在操作时随手携入。,（三）洗手和着装 原
14、则上与外科手术洗手相同：先用肥皂刷洗手和前臂，再用流水冲洗，然后用0.2新洁尔灭或75洒精棉球擦洗。穿无菌服，戴无菌帽和口罩。 （四）无菌培养操作 在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作，如安装吸管橡皮头、打开瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行（火焰消毒）。,注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长，以防退火。烧过的用具要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。 进行细胞培养操作时，动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 不能用手触及器皿的无菌部分，如已接触，要更换或用火焰烧灼触及部。,为拿取方便，工作台面上的布局要合理，原则上为右手使用方便的用品放
15、在右侧，左手用品在左侧。 培养液等不要过早开瓶，不要长时间直立暴露开口，以免增加污染机会。 吸取不同用液时，均应分别使用不同的吸管，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。,八、显微技术,各种显微镜技术 同细胞生物学要掌握原理与应用,九、细胞观察与分析,细胞在培养过程中，要及时观察和了解生长增殖状况，包括新生、增殖、消亡等各种状态的时间参数、细胞数量、分布位置等指标，以及体外因素对这些指标的调节机制。这属于细胞动力学的研究。广义的细胞动力学还包括其它的细胞运动及其原理的研究。,（一）细胞技术与活力分析,1、细胞计数法 用血球计数板计数细胞悬液中的细胞数目，然后根据需要进行必要的调整。 2、细胞生
16、长曲线 生长曲线是反映培养细胞的时间与培养细胞浓度之间关系的曲线。以时间（横坐标）对细胞浓度（细胞数/ml为纵坐标）绘制，反映培养过程中细胞生长与死亡的动态变化。,3、有丝分裂指数的测定 在一群细胞中，进入分裂期细胞所占该群细胞的百分率，即为有丝分裂指数。它反映了细胞增殖的速度。 分裂细胞数 分裂指数 = 100% 细胞总数 4、细胞贴壁率 又称接种存活率，贴壁附着生长的细胞状况直接反映细胞的生存能力。,5、流式细胞仪检测细胞周期 细胞周期各时相控制并按一定的时间顺序予以表达的，而细胞周期各时相的分析，特别是细胞周期及其各时相时长的测定对于研究细胞群体的生长行为，尤其是对于包括DNA复制、细胞分裂在内的细胞增殖调节控制的研究，无疑是一个很重要的前提。,基本步骤 细胞培养 消化细胞计数 种植60 mm 培养皿（70 X104 个细胞/皿） 药物处理细胞 收细胞（胰蛋白酶消化-培养基终止） 2000转/分
