《{医疗药品管理}基因工程制药培训》由会员分享，可在线阅读，更多相关《{医疗药品管理}基因工程制药培训（79页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基因工程制药简介,张义浜 2017-05-20,概述 目的基因的获得 基因的表达 基因工程菌的培养 基因工程药物的分离纯化,传统制药（生化制药）存在的问题: 1.材料来源或制造技术困难而无法研制出产品； 2.从动物脏器中提取易感染病毒； 3.存在免疫原性，使用受限制。,基因工程制药的优点,大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽 提供足够数量的生理活性物质 发现更多的内源性生理活性物质 利用基因工程和蛋白质工程对生理活性物质进行修饰和改造，提高药效价值 获得新型化合物，扩大药物筛选来源,基因工程技术所生产的药物,用传统方法很难生产的，主要是药用活性蛋白质/多肽，包括： （1）免疫相关蛋白-各种
2、抗原、单克隆抗体。 （2）细胞因子-如IFN、IL、CSF、EGF、VIII、EPO （3）激素-胰岛素、生长激素、心钠素、人脑激素、人松驰激素。 （4）酶类-尿激酶、链激酶、葡聚糖酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、SOD、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。,早期部分基因工程产品的研制、开发、上市时间,我国批准上市的部分生物技术药物,什么是基因工程技术？ 基因工程（genetic engineering）：也称基因操作、遗传工程，重组体DNA技术，基因克隆或分子克隆，指将不同生物的遗传物质基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转入
3、微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。,制备基因工程药物的基本过程,获得目的基因 构建重组质粒 组建基因工程菌 (或细胞) 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装,选择表达系统主要考虑： 必须保证所表达的蛋白质具有生物活性 考虑基因工程蛋白质表达量的多少 蛋白质分离纯化的难易程度,基因的克隆,目的基因的获得,一、反转录法 二、反转录PCR 三、化学合成法,常用的方法:,一、反转录法 为了克隆编码某种特异蛋白质 多肽的DNA序列，可以从产生该蛋 白质的真核细胞中提取mRNA, 以 其为模板，在反转
4、录酶的作用下， 反转录生成该蛋白质mRNA互补 DNA（cDNA第一链），再以cDNA 第一链为模板，在DNA聚合酶作 用下，最终合成编码该多肽的双链 DNA序列。,二、反转录PCR 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模 板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA 第一链，直接以其为模板（不需要合成cDNA第二链）进行PCR扩增，获得目的基因，用于重组、克隆。,三、化学合成法 前提：核苷酸序列已知；或已知其蛋白质的氨基酸序列，再推导出核苷酸序列 限制性： 1）不能直接合成太长的基因； 2）遗传密码的简并性可导致中性突变； 3）成本较高,DNA合成仪,基因的克
5、隆与表达,基因表达：基因在生物体中的转录、翻译及所有加工过程。 基因高效表达：外源基因在某种宿主细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，重组到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。 基因表达研究的主要问题：目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。 建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键,一、宿主菌的选择 宿主菌应满足以下要求： 具有高浓度、高产量、高产率； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 方便重组DNA操作； 产物容易提取纯化。,1.原核细胞
6、 （1）大肠杆菌 表达产物的形式：细胞内不溶性表达(包涵体)、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少数情况下也可分泌到细胞外。不同的表达形式具有不同的表达水平及完全不同的杂质。,大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组测序，遗传背景清楚（共4405 ORF） 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,缺陷,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素,（2）枯草芽孢杆菌 分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包涵体；不能使蛋白质
7、糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解,（3）链霉菌 重要的工业微生物。不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有一定的糖基化能力,2、真核细胞 （1）酵母 特点： 真核生物细胞，表达产物能糖基化； 基因组小，仅为大肠杆菌的4倍； 世代时间短，繁殖迅速； 基因操作与原核生物相似； 建立了有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。,（2）丝状真菌 特点： 有很强的蛋白分泌能力； 能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等; 其糖基化方式与高等真核生物相似； 丝状真菌（如曲霉等）等被确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺。,真
8、核生物和原核生物基因表达过程示意图,克隆载体: 克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加 表达载体: 将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质 插入型载体: 将外源基因或DNA插入其中 置换型载体: 切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。,载体（vector）,质粒（plasmid）,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主细胞染色体外而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。绝大多数质粒是DNA型的，天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。基因克隆的载体质粒DNA分子都具有复制子、选择性标记、克隆位点。,原核细胞表达载体,非融合型p
9、KK223-3 分泌型PIN-ompA1,融合蛋白表达载体pGEX结构,包涵体型pBV220结构,融合蛋白表达载体 非融合型表达载体 分泌型表达载体 包涵体型表达载体,（一）表达载体 表达载体必须具备的条件： 载体能够独立的复制； 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记, 且克隆位点应在启动子序列后，以便外源基因表达； 具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶识别； 具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录； 具有很强的终止子，使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因； 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。
10、,（二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的剂量 外源基因的表达效率： A、启动子的强弱：将目的基因插入大肠杆菌RNA聚合酶能识别的强启动子下游 B、核糖体结合位点的有效性 C、SD序列和起始密码的间距 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码子,表达产物的稳定性： A、组建融合蛋白； B、利用信号肽将真核基因产物搬至周质空隙中； C、位点特异性突变，增加蛋白的稳定性； D、采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌，减弱降解作用 细胞的代谢负荷： A、宿主细胞的生长与外源基因的表达分开； B、宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开； C、形成不溶性的包涵体 工程菌的培养条件,（三）
11、真核基因在大肠杆菌中表达的形式 1.以融合蛋白的形式表达药物基因 其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，以原核多肽和真核蛋白结合在一起，称融合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，不易被 细菌酶类降解；易实现高效表达； 缺点：有免疫原性，需切除原核多肽,2.以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏；可能引起人体免疫反应,3.分泌型表达蛋白药物基因 将外源基因融合到编码信号肽序列的下游。 常用的信号肽有：碱性磷酸酶信号肽；膜外周质蛋白 信号肽；霍乱弧
12、菌毒素B亚单位； 优点：在周质中稳定，有活性，不含甲硫氨酸残基； 缺点：产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。,酵母中的基因表达 （一）表达载体 1.载体的复制序列 （1）YEp类（酵母附加体质粒） （2）YRp类（酵母复制型质粒） （3）YCp类（酵母着丝粒质粒） （4）YIp类（酵母整合型质粒）,2. 克隆载体 向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori部 分和Ampr或Tetr部分，这样构成的克隆载体同时带 有细菌和酵母的复制原点和选择标记。 酵母常用的选择性标记：氨基酸或核苷酸合成酶 系基因，对抑制酵母生长的药物具有抵抗力的抗性 基因,3.表达载体 普通表达载体：只能方便
13、地引入外源基因并进行表 达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸 是否增减并无严格要求。 精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的 适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并 使它在表达和加工后N末端氨基酸序列与天然产物 相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。,（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素 1.外源基因的剂量：质粒拷贝数及其在宿主细胞内的稳定性 2.外源基因的表达效率： A、启动子 B、分泌信号的效率 C、终止序列的影响,3.外源蛋白的糖基化 4.宿主菌株的影响： A、菌体生长力强； B、菌体内源蛋白酶要弱； C、菌株性能稳定； D、分泌能力强,基因工程菌的培养,基因工
14、程菌发酵的基本操作方式有： 分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限 半连续培养（补料分批） 在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物 连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。 透析培养 固定化培养,基因工程菌培养方式,补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基
15、因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。,连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了良好的条件。 但由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产
16、率。,透析培养 透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。 采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环，在补料分批培养中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密度菌体。 膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响,固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。,基因工程菌发酵中试,基因工程菌中试应考虑的问题：适宜商品化生产的工程菌
