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1、第三节 基因工程制药生产的基本过程,一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例,血红蛋白基因,血红蛋白基因排列顺序,血红蛋白的结构,血红蛋白的运送氧气功能,血红蛋白的基因工程流程,一、工具酶的分离纯化,（一）基因工程制药所用到的工具酶 （二）关于限制酶 （三）关于连接酶,（一）基因工
2、程制药所用到的工具酶,限制性内切酶 甲基化酶 Klenow聚合酶T4-DNA聚合酶 T4-多核苷酸激酶碱性磷酸酶 核酸酶-S1核酸酶-Bal31 绿豆核酸酶 核糖核酸酶 人外切核酸酶DNA酶-1 外切RNA酶-III外切RNA酶-VI DNA聚合酶1 T4-DNA连接酶 末端脱氧核苷酸转移酶T4-RNA连接酶 逆转录酶 大肠杆菌-DNA连接酶,（二）关于限制酶,1、宿主限制现象 2、限制酶的定义 3、限制酶的特征 4、限制酶的作用 5、基因工程所用到的限制酶 6、影响限制酶作用的因素,1、宿主限制现象,病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受到宿主B的限
3、制,这种现象是宿主控制性限制 （restriction）与修饰(modification) ,简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。,R/M体系： 是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶,当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化
4、。 EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化 的序列。,R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解,ECOB核酸酶,甲基化酶,CH3,CH3,CH3,CH3,噬菌体来源序列,宿主来源序列,限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。 由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。,2、限制酶的定义,凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的酶称为限制酶。限制酶分为三个类型： （1）型限制酶-由于其切点不固定，很难形成特异性的切割末端。 （2）型限制酶-是位点特异性酶
5、，是基因工程理想的工具酶。 （3）型限制酶-对DNA的识别与切割点不同，不产生特异性DNA片段。,3、限制酶的特征,具有专一性的识别位点。 能够形成固定的核苷酸单链末端。 比较适合于进行DNA结构的分析和进行基因重组。,4、限制酶的作用,（1）进行DNA重组。 （2）构建新载体。 （3）构建基因文库。 （4）进行DNA序列分析。 （5）制备DNA放射性探针。,5、基因工程所用到的限制酶,通常是型限制酶，具体有以下几种。 EcoR-IHind-IIIBamH-I Pst-I Sst-ISal-I Ava-I Bcl-IHind-II Hpa-I Bgl-II Cla-I Hae-IIIHha-I
6、Hinf-I Hpa-IIMbo-ISma-I Xba-I Xho-I,6、影响限制酶作用的因素,（1）DNA的纯度 （2）DNA的甲基化程度 （3）DNA的结构 （4）反应的温度-最适温度为37度 （5）反应的缓冲体系-反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。,（三）关于连接酶,1、定义-凡是能够催化DNA片段5-末端的磷酰基与3-末端的羟基结合成磷酸二酯键的酶，称为连接酶。 2、作用-主要用于（1）正常DNA的合成。（2）损伤DNA的修复。 3、种类（1）DNA-连接酶-广泛存在于生物细胞之中，主要取自于大肠杆菌E
7、.coli。（2）T4-DNA连接酶-来自于经过T4-噬菌体感染的大肠杆菌E.coli。 （3 T4-RNA连接酶-催化单链DNA或RNA的5磷酸与另一单链DNA或RNA的3羟基之间形成共价连接。,二、基因工程载体的分离纯化,（一）定义 （二）基因工程载体的必备条件 （三）基因工程载体的种类,（一）定义,能够将目的基因携带进宿主细胞、并可使得目的基因能够在宿主体内进行自主性复制的遗传因子，称为基因工程载体。,（二）基因工程载体的必备条件,（1）具有有效运载能力。（2）载体自身能够独立复制，并且在宿主体内进 行自主性复制。（3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体内进行自主性复制。（4）在宿主
8、体内，能够控制外源基因的表达活动。（5）能够携带大小不同的外源性目的基因。（6）鉴定方便、装卸技术简单。（7）容易控制、安全可靠。,（8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选标记。（9）应具有很强的启动子。（10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。（11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源基因区段，而不转录其它无关基因。（12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够顺利于进行翻译。,（三）基因工程载体的种类,1、细菌质粒 2、真核基因病毒DNA 3、噬菌体DN
9、A 4、单链DNA噬菌体M13载体 5、人工质粒载体-科斯质粒 6、酵母人工染色体 7、其他载体,1、细菌质粒,（1）质粒的定义 （2）质粒的特性 （3）质粒的分类 （4）质粒载体的具备条件 （5）常用的细菌质粒,（1）质粒的定义,存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，常带有细菌的抗药基因。也存在于某些真核细胞（酵母的2环状质粒）,质粒载体(plasmid),（2）质粒的特性,独立于细菌染色体之外的环状DNA或RNA。 其遗传特性属于非染色体控制。 能够进行自我复制。 容易在宿主体内进行转移和迁移。 可编码宿主染色体所不具有的基因。能够赋予宿主额外的
10、遗传特性：A、编码产生抗生素酶的抗性基因，B、编码产生糖酵解酶系的基因，C、编码产生抗重金属酶的抗性基因。,质粒的复制类型,严谨型（strigent plasmid)： 复制与宿主染色体同步受宿主染色体复制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约份拷贝。,松弛型（relaxed plasmid): 复制不受宿主染色体复制的 限制可独立复制，在宿主细胞中拷 贝数高，宿主细胞中质粒有10-200拷贝。基因工程常用载体。,质粒DNA的构型,三种不同的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持
11、着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)； 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。,共价闭合环形DNA （SC型）,开环DNA （oc型）,线性DNA （L型）,环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型,（3）质粒的分类,F质粒-可使宿主A的部分基因随着F质粒一起转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。 R质粒-可编码宿主A的一种或者数种抗生素抗性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的另一宿主B的体内，使得宿主B也获得同样的抗性。 Col质粒-能编码大肠杆菌毒素基因，通过表达之后产生的大肠杆菌毒素可以使得不带Col质粒的其它菌株死亡。,（
12、4）质粒载体具备条件,质粒载体，也称质粒克隆载体，是指用于实现基因工程操作的质粒。必须具备以下条件： （1）其分子结构中必须具有多个单一限制酶的切割位点。 （2）构建重组质粒之后必须具有转化功能。 （3）分子量较小，易于操作。 （4）宿主范围较为单一、无感染性。,（5）常用的细菌质粒,pBR322pBH10pBH20 pTR262pAT153pXf3 Pmk16pGEM-3ZpUC19 A、pBR322质粒 B、pUC19质粒 C、pGEM-3Z 质粒,A、 pBR322质粒, 4363 bp 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素基因(ampR) 一个抗四环素基因 (tetR) ampR和tetR
13、抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入 当外源基因插入抗药基因内，抗药基因失活。AmpRAmp敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS).,pBR322:人工构建重要质粒,优点：具有较小的分子量 具有两种抗生素抗性基因，作为筛选标记 具有高拷贝数 是松弛型质粒,B、 pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体； （1） 2674bp； （2） 有ampR和位于lacZ+ 基因中靠近5端多克隆位点(MCS)和来源于pBR322质粒的复制起始点 （3）大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ+基
14、因，便于蓝白筛选,pUC质粒优点： 具有更小的分子，更高的拷数 适于组织化学检测重组体,C、 pGEM-3Z质粒,含一个ampR基因和一个lacZ编码基因; 有多克隆位点（MCS）; 正选择颜色标记 lacZ; 有两个来自噬菌体的强启动子PT7和PSP6,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3Z,PSP6,2、真核基因病毒DNA,（1）病毒载体的优点 （2）已经研究的真核基因病毒DNA
15、,（1）病毒载体的优点,A、具有很高的拷贝数量。 B、有强大的启动子。 C、可保证目的基因的高效表达。,（2）已经研究的真核基因病毒DNA,A、SV40病毒DNA B、牛乳头瘤病毒 C、RNA病毒 D、昆虫杆状病毒 E、人痘病毒DNA F、猴空泡病毒DNA G、人腺病毒DNA H、人牛痘病毒DNA I 、逆转录病毒载体,A、SV40病毒DNA,（A1）、 SV40病毒DNA的特性 （A2）、SV40病毒DNA的基因组 （A3）、SV40病毒DNA载体的构建 （A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法,（A1）、SV40病毒DNA的特性,为环状双螺旋结构。其宿主为动物细胞。 SV40病毒有二种表
16、达方式：（1）游离表达方式，SV40DNA+外源性DNA，形成重组DNA，进入宿主体内，以重组DNA的方式表达。（2）结合表达方式，重组DNA整合到宿主染色体的DNA之中，与染色体基因一起表达。,（A2）、SV40病毒DNA的基因组,（A3）、SV40病毒DNA载体的构建,（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法,G、腺病毒,（G1）、腺病毒DNA载体 （G2）、腺病毒DNA载体的特点,3、噬菌体DNA,（1） 噬菌体DNA的特性 （2） 噬菌体DNA的改造 （3） 噬菌体DNA的体外包装 （4） 噬菌体载体的构建 （5） 噬菌体载体的使用 （6） 噬菌体载体的优点,（1）噬菌体DNA的特性,噬菌体DNA为双链的DNA病毒，宿主是大肠杆菌。 已发现噬菌体DNA可编码61个基因。 A、噬菌体DNA在宿主体内的生活方式 B、噬菌体DNA的结构,A、噬菌体DNA在宿主体内的生活方式,（1）溶源方式：噬菌体DNA整合到大肠杆菌的
